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研究目的:脑卒中是全球性的常见病。临床上,80%脑卒中为缺血性脑卒中。现阶段,临床能有效治疗缺血性脑卒中的手段仅限于溶栓或机械取栓治疗。由于治疗时间窗短且需严格掌握适应症,只有3%-5%的脑卒中患者有机会接受溶栓治疗。在前期研究中我们发现硫化氢缓释供体5-对羟基苯基-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮（5-（4-methoxyphenyl）-3H-1,2-dithiole-3-thione,ADT-OH）可以促进脑缺血后神经功能的长期恢复,但机制尚不清楚。本课题组最新研究发现:硫化氢（Hydrogen Sulfide,H2S）被硫醌氧化还原酶（Sulfide-quinonereductase,SQR）氧化后驱动线粒体复合物I的反向电子传递,从而激活解偶联蛋白2（uncoupling protein 2,UCP2）及下游的AMP 激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）,由此导致 H2S 的胞内信号传导。本课题将探讨ADT-OH是否通过小胶质细胞SQR介导的信号传导通路发挥促进血管新生,从而改善脑缺血后神经功能损伤的作用。研究方法:1)我们利用线栓法在野生型小鼠（Wild type,WT）上建立大脑中动脉阻塞模型（middle cerebral artery occlusion,MCAO）以模拟脑缺血。把造模小鼠随机分成给药组和溶剂组,在术后24 h起给药组小鼠腹腔注射ADT-OH（50 mg/kg/day）,溶剂组小鼠腹腔注射等量的溶剂,直至术后第30天。在这30天内,我们每隔一天进行神经功能缺损性评分（mNSS）、转角实验评分（Corner test）、前肢触碰评分（forelimb placement）,并在术后第1、7、14、28天进行疲劳转棒评分（rotarod test）。通过统计30天内各组小鼠每项行为学,检测其神经功能恢复情况。2)我们在小鼠术后30天收取脑组织进行冰冻切片,以免疫组织化学方法检测小鼠大脑皮层缺血周边区血管密度,同时通过相关性分析检测缺血周边区的血管密度与行为功能恢复是否呈正相关。3)我们采用在小胶质细胞和巨噬细胞上特异性敲除sqr的基因工程小鼠（Cx3cr1cre:Sqrfl/fl）来研究H2S是否通过小胶质/巨噬细胞SQR发挥作用。首先我们对小胶质细胞和巨噬细胞上特异性敲除sqr的基因工程小鼠（Cx3cr1cre:Sqrfl/fl）和对照小鼠（Sqrfl/fl）进行MCAO手术,以模拟脑缺血,缺血1h后再灌注。再灌注24h后,给药组小鼠腹腔注射ADT-OH（50 mg/kg/day）,溶剂组小鼠注射同等剂量溶剂,直至手术后30天。每隔一天进行mNSS评分、Corner test评分、forelimb placement评分,并在术后第1、7、14、28天进行rotarod test评分。我们以此4种行为学评分为依据,检测各组小鼠神经功能的恢复情况。同时,我们在小鼠术后30天收取脑组织,以免疫组织化学方法检测小鼠大脑皮层缺血周边区血管密度,并通过相关性分析检测缺血周边区的血管密度与行为功能恢复是否呈正相关。4)血管内皮生长因子（Vascular endothelial grown factor,VEGF）是促进血管新生最重要的内源性因子。为探究VEGF是否介导H2S在脑缺血后促进血管新生,我们用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,在 MCAO 后检测注射ADT-OH或溶剂的WT小鼠缺血侧和对侧皮层VEGF的蛋白表达水平。其次,在小胶质细胞和巨噬细胞特异性敲除sqr的基因工程小鼠和对照小鼠造MCAO模型后,我们用ELISA检测缺血侧和对侧皮层的VEGF的蛋白表达水平。我们新选取一批小鼠造MCAO模型,MCAO后24小时起每天腹腔注射ADT-OH（50 mg/kg/day）或等量的溶剂,持续30天;同时,我们隔天给小鼠静脉注射VEGF抗体（2 mg/kg）,持续至脑缺血后第10天,以阻断内源性VEGF的作用;并以注射等量对照抗体的小鼠作对照。在这30天内,我们每隔一天进行mNSS评分、Corner test评分、forelimb placement评分,并在术后第1、7、14、28天进行rotarod test评分。以此4种行为学评分为依据,检测各组小鼠神经功能的恢复情况。我们在小鼠术后30天收取脑组织,以免疫组织化学方法检测小鼠大脑皮层缺血周边区血管密度;并通过相关性分析检测缺血周边区域的血管密度与行为功能恢复是否呈正相关。5)我们利用细胞模型研究脑缺血后ADT-OH促进血管新生的分子机制。为模拟脑缺血后小胶质细胞的激活,我们以原代神经元细胞缺糖缺氧（oxygen-glucose deprivation,OGD）后的条件上清处理BV-2小胶质细胞。将脑微血管内皮细胞bEnd.3培养在基质胶上,我们以bEnd.3细胞在基质胶上形成管状结构的能力表征体外血管新生。以上述细胞模型探究小胶质细胞以神经元OGD条件上清处理后对bEnd.3细胞体外新生血管能力的影响。我们应用针对SQR的小干扰RNA（siSQR）敲减BV-2小胶质细胞SQR,探究H2S在细胞模型促进体外血管新生的作用是否依赖于SQR。我们应用针对VEGF的小干扰RNA（siVEGF）敲减BV-2小胶质细胞VEGF,探究H2S在细胞模型促进体外血管新生的作用是否依赖于VEGF。为探讨H2S通过SQR信号通路调控小胶质细胞表达VEGF的分子机制,我们敲减小胶质细胞SQR、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氧酶铁-硫蛋白 3（nicotinamide-adenine dinucleotide dehydrogenase（ubiquinone）Fe-S protein 3,NDUFS3,线粒体复合物 Ⅰ 组成亚基之一）、UCP2 或 AMPK,再以神经元OGD条件上清处理上述BV-2小胶质细胞,以ELISA检测BV-2小胶质细胞中VEGF蛋白表达的变化。实验结果:1)与溶剂相比,ADT-OH可促进小鼠脑缺血后神经功能的恢复。2)ADT-OH提高脑缺血后血管密度,而且血管密度与脑缺血后小鼠的神经功能恢复呈正相关。3)特异性敲除小胶质/巨噬细胞sqr基因后,ADT-OH在动物脑缺血模型提高血管密度以及促进神经功能恢复的作用被阻断。4)利用VEGF抗体阻断内源性VEGF作用后,ADT-OH在动物脑缺血模型提高血管密度以及促进神经功能修复的作用被阻断。特异性敲除小胶质/巨噬细胞sqr基因后,ADT-OH在动物脑缺血后促进缺血皮层VEGF表达的作用被阻断。5)细胞实验表明:在BV-2小胶质细胞敲减SQR或VEGF后,ADT-OH促进内皮细胞体外血管新生的作用被阻断。6)细胞实验表明:BV-2小胶质细胞敲减SQR或NDUFS3能阻断ADT-OH在模拟脑缺血条件下促进BV-2小胶质细胞表达VEGF的作用,但敲减BV-2小胶质细胞UCP2和AMPK不能阻断ADT-OH促进BV-2小胶质细胞表达VEGF的作用。结论:硫化氢缓释供体ADT-OH可能通过血管新生在脑缺血后促进神经功能恢复,机制可能是通过小胶质/巨噬细胞SQR上调VEGF表达。