【摘 要】
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目的:壬基酚作为人为来源的典型环境内分泌干扰物,具有拟雌激素作用,并可在环境中广泛存在,可通过生物蓄积进入人体,造成机体多个系统功能紊乱。目前对壬基酚（NP）造成的胰腺功能损伤及其毒性机制研究较少。本实验采用体外培养大鼠胰岛β细胞株（INS-1细胞）暴露于壬基酚,观察壬基酚暴露对细胞的影响,为探讨壬基酚对胰岛β细胞的损伤作用及其可能机制提供实验基础资料。方法:（1）CCK-8 法检测 INS-1
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目的:壬基酚作为人为来源的典型环境内分泌干扰物,具有拟雌激素作用,并可在环境中广泛存在,可通过生物蓄积进入人体,造成机体多个系统功能紊乱。目前对壬基酚（NP）造成的胰腺功能损伤及其毒性机制研究较少。本实验采用体外培养大鼠胰岛β细胞株（INS-1细胞）暴露于壬基酚,观察壬基酚暴露对细胞的影响,为探讨壬基酚对胰岛β细胞的损伤作用及其可能机制提供实验基础资料。方法:（1）CCK-8 法检测 INS-1 细胞暴露不同浓度NP（0、0.1、1、10、25、50、75μmol/L）存活率;（2）不同浓度NP（0、0.1、10、50μmol/L）染毒INS-1细胞。酶联免疫吸附试验法检测INS-1细胞的胰岛素分泌水平;流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）、细胞凋亡、线粒体膜电位（MMP）、游离钙离子[Ca2+]i的水平;WST-8法检测细胞内线粒体中超氧化物歧化酶（SOD）活性、硫代巴比妥酸法（TBA）法检测丙二醛（MDA）含量、实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测胰十二指肠同源基因1（PDX-1）mRNA、葡萄糖转运蛋白2（Glut2）mRNA的表达;（3）采用褪黑素（Mel）处理壬基酚暴露组细胞,观察实验组（10μmol/L壬基酚、10μmol/L壬基酚+100nmol/L褪黑素）与对照组细胞内活性氧、细胞凋亡水平、胰岛素分泌水平的变化;采用Western blot法和实时荧光定量PCR分别检测对照组与实验组细胞内P53、P21、鼠双微体2（MDM2）、核因子E2相关因子2（Nrf2）、醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白和mRNA水平。结果:（1）CCK-8实验结果显示,与对照组比较,10、25、50、75μmol/LNP处理组细胞存活率显著降低;酶联免疫吸附结果显示,INS-1细胞胰岛素分泌水平随着NP染毒剂量的增加,先升高后降低;流式细胞术检测结果显示:实验组INS-1细胞中ROS、凋亡、[Ca2+]i水平与对照组相比显著升高;随着NP处理剂量的升高,实验组MMP水平随着NP染毒剂量的增加而降低;WST-8法检测结果显示细胞内SOD活性随着染毒剂量的升高而降低,且1、10、50μmol/LNP染毒组与对照组比较显著降低;硫代巴比妥酸法检测结果显示细胞内MDA水平随着NP染毒剂量的升高而升高;实时荧光定量PCR结果显示,与对照组比较,Glut2 mRNA表达随着NP染毒剂量的升高而降低,而PDX-1 mRNA水平无明显变化。（2）采用褪黑素（Mel）干预壬基酚暴露INS-1细胞实验结果显示:NP+Mel组胰岛素分泌水平与NP组相比显著升高;NP+Mel组与NP组相比,凋亡、ROS水平降低;NP组和NP+Mel组细胞P53、P21、NQO1 mRNA水平与对照组比较均显著升高、MDM2mRNA水平降低,而Mel+NP组与NP组比较P53、P21mRNA水平降低、MDM2、NQO1 mRNA水平升高,Nrf2mRNA水平无明显变化;Western blot结果表明:NP组和Mel+NP组细胞内P53、P21、Nrf2、NQO1蛋白水平与对照组比较显著升高,而MDM2蛋白水平则降低;Mel+NP组细胞内P53、P21蛋白水平与NP组比较显著降低,MDM2、Nrf2、NQO1蛋白水平升高。结论:1.NP暴露剂量（0-50μmol/L）与INS-1细胞胰岛素分泌水平呈倒“U”型关系;2.NP暴露可诱导INS-1细胞线粒体损伤和氧化应激;3.以褪黑素为干预物,进一步验证了 NP可能通过氧化应激途径诱导INS-1细胞的氧化损伤,并且褪黑素处理可以减轻壬基酚导致的细胞氧化损伤;4.NP通过P53介导的MDM2-P53-P21信号通路,以及P53协同P21调节抗氧化基因Nrf2及其下游基因NQO1诱导细胞氧化损伤,抑制INS-1细胞的胰岛素分泌。
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