柑橘杂色褪绿病PCR检测技术与黄龙病传毒率及在春梢中的分布研究

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柑橘杂色褪绿病(Citrus Variegated Chlorosis,CVC)是由木质部难养菌Xyllela fastidiosa引起的一种严重病害,已知分布在巴西、阿根廷、乌拉圭等南美国家。CVC自上世纪八十年末在巴西发现以来,已经对巴西柑橘产业造成严重打击。我国尚未发现有CVC,但是随着引种频率加大,存在CVC传入我国的风险,因此严格的检疫是限制CVC传入我国的有效途径,其效果取决于CVC检测方法的建立和完善。国外对CVC检测技术研究较深入,其中PCR方法是目前检测CVC最为灵敏、快捷的方法。本研究选取了国外已发表的五对引物对CVC进行PCR扩增,通过优化各反应条件,建立了五种检测CVC的常规PCR体系和一种巢式PCR体系,比较了六种体系的灵敏性和特异性;将PCR的扩增产物在NCBI中使用BLAST与CVC的标准序列进行了比对;并将所建立的体系应用于实际检测中,检测了来自巴西的疑似CVC样品,主要结论如下:1.本研究选取了五对引物建立了检测CVC的五种常规PCR体系和一种巢式PCR体系,五种常规PCR体系扩增出的片断长度分别为137 bp、500 bp、603 bp、745 bp和700bp,灵敏度级别分别为1ng、10pg、0.1ng、0.1ng:巢式PCR扩增的片断长度为500bp,灵敏度级别为1Pg。五种常规PCR体系利巢式PCR体系都不能扩增出柑橘黄龙病(HLB)和柑橘溃疡病(Citrus canker)。2.PCR产物的核苷酸序列与已知CVC标准序列的比对结果表明,五种常规PCR体系的扩增产物与CVC标准序列的同源性高达98%以上,扩增条带都为CVC目的条带。3.按照微量快速抽提法,对米自巴西圣保罗不同地点的四个农场中的疑似CVC样品进行总核苷酸抽提;用引物272-1-int/272-2-int的常规PCR及巢式PCR分别对抽提样进行检测,两种方法检测结果一致,35个样品中有8个检测到了CVC病原。柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由韧皮部杆菌属(Liberibacter)引起的一种毁灭性病害。我国对HLB的研究较深入,本研究对HLB通过不同嫁接接种方法(皮接和芽接)的传毒率情况和在不同生长期春梢中的分布进行了检测,以期为选择合适的嫁接方法保存HLB毒源和明确春季检测HLB病原的植株取样部位提供理论依据。主要结论如下:1.从2006年8月到12月逐月采样及2007年4月采样,用常规PCR检测通过不同嫁接接种方法(皮接和芽接)的HLB传毒情况。结果表明,芽接HLB的传毒率明显高于皮接HLB的传毒率,其检出率分别为50%和15.4%。2.从2006年4月下旬到7月中旬每半个月采样一次,用常规PCR检测HLB在甜橙苗木春梢叶片中的分布。结果表明,春梢叶片成熟前检测不到HLB,5月,随着春梢叶片开始成熟,部分样品可以检测到HLB,待春梢叶片成熟两个月后,基本全部样品可以检测到HLB。
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