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瘢痕疙瘩(keloid)是一种良性的皮肤纤维增生性疾病,通常源于皮肤创伤并向周围扩展超过原有损伤范围。该病的特征是胶原等细胞外基质(ECM)过度沉积,瘢痕呈持续增长而无自愈倾向。瘢痕疙瘩不仅影响美观,还能引起疼痛、瘙痒等伴随症状,发生在关节部位甚至影响关节功能。迄今为止,其具体发病机理仍不明确,可能与细胞因子(如TGF-β)、胶原代谢障碍、遗传因素等有关。由于单纯手术切除后极易复发,目前国内外通常采用药物注射、外科手术、局部放疗、加压疗法等多种治疗手段相结合,然而目前仍无理想的治疗方法。Wnt/β-catenin信号通路在诸如细胞增殖凋亡,细胞分化和肿瘤形成等多种生理活动中起到重要作用。近几年,越来越多的证据表明Wnt/β-catenin信号传导通路与包括病理性瘢痕在内的多种纤维化疾病的发病机制相关,例如在瘢痕疙瘩组织中β-catenin表达显著增强,用TGF-β刺激成纤维细胞能导致Wnt/β-catenin信号传导通路上调。另有研究表明与正常皮肤相比,瘢痕疙瘩中Wnt5a和β-catenin的表达也明显增强。这些结果提示Wnt/β-catenin信号传导通路可作为瘢痕疙瘩等纤维化疾病的潜在治疗靶点。已有报道表明使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂能减弱肺和肾脏的纤维化程度。IWR-1是一种小分子Wnt/β-catenin信号通路抑制剂,能抑制端锚聚合酶,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。端锚聚合酶促进Axin蛋白的蛋白酶体降解作用,而Axin蛋白是β-catenin破坏复合体的主要组成部分。因此抑制端锚聚合酶能稳定Axin蛋白,导致β-catenin降解增加从而抑制Wnt/β-catenin信号传导通路。目的:通过检测Wnt/β-catenin抑制剂IWR-1对成纤维细胞增殖、迁移、胶原生成、肌成纤维细胞分化的作用及对基质金属蛋白酶(MMPs)活性的影响,探讨了 IWR-1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的可能作用机制。方法:1.采用组织块培养法培养正常皮肤成纤维细胞(NF)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF),应用镜下观察、HE染色和波形蛋白免疫组化染色方法鉴定成纤维细胞。2.采用不同浓度的IWR-1处理NF和KF,24h后收集上清,用LDH细胞毒性检测试剂盒检测LDH活性,评估IWR-1作用于成纤维细胞后的细胞毒性。3.用载TOPflash或FOPflash的荧光素酶报告基因腺病毒转导成纤维细胞,用不同浓度IWR-1作用NF和KF 24h后,以FOPflash荧光素酶报告基因作为对照,进行荧光素酶活性检测,评估IWR-1对成纤维细胞内源性Wnt/β-catenin信号通路活性的影响。4.接种相同数目的NF和KF,采用不同浓度IWR-1处理24、48和72h后,进行细胞计数及描绘生长曲线,用于检测IWR-1对细胞增殖的影响。同时将NF和KF接种培养至完全融合,用枪头在每个孔中央细胞表面划出平滑的划痕,加入不同浓度IWR-1培养24h,计算细胞迁移率,评估IWR-1对细胞迁移的影响。5.将20μM IWR-1作用于NF和KF 48h,收集细胞提取蛋白,用western blot方法检测IWR-1对胶原蛋白表达影响;收集上清液用Ⅰ型前胶原C-肽酶免疫检测试剂盒检测上清液中Ⅰ型前胶原C-肽的含量。6.将NF或KF分别与胶原凝胶混合均匀,在Transwell 6孔板中聚合后游离胶原块,加入20μMIWR-1,连续7天每天观察胶原凝胶的收缩情况,评估IWR-1对成纤维细胞介导的胶原收缩的作用。7.将NF或KF用IWR-1预处理1h,加入5ng/mLTGF-β1作用1h或24h,用western blot方法检测磷酸化Smad2/3蛋白表达量及α-SMA表达量;低密度的NF和KF接种后用20μM IWR-1预处理1h,加入5ng/mL TGF-β1作用48h,固定后用罗丹明标记的鬼笔环肽室温下避光孵育1h,荧光显微镜下观察IWR-1对TGF-β1刺激后成纤维细胞应力纤维数量的影响,评估IWR-1对成纤维细胞TGF-β/Smad通路和肌成纤维细胞分化的作用。8.将20μM IWR-1作用于NF和KF 48h,分别收集细胞和培养液,用western blot方法检测IWR-1对成纤维细胞MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达影响;提取细胞RNA,用RT-PCR方法检测IWR-1对成纤维细胞MMP-1、MMP-3和MMP-13 mRNA表达水平的作用;收集培养液浓缩上样并进行SDS-PAGE(含1mg/mL明胶),用明胶酶谱法分析IWR-1对成纤维细胞MMP活性的影响,评估IWR-1对成纤维细胞MMPs的作用。结果:1.成纤维细胞形态学及鉴定细胞形态多呈长梭形,在对数生长期时显微镜下细胞排列成簇,多呈放射状,编织状或旋涡状排列。HE染色下细胞为多角形或长梭形,胞核为淡蓝色,胞浆为粉红色,波形蛋白免疫组化染色见胞质阳性,结合组织来源,证实该细胞为皮肤成纤维细胞。2.IWR-1对成纤维细胞的细胞毒性影响在NF和KF中,20μM IWR-1作用24h没有明显增加LDH的释放,但是在50μM浓度时,LDH释放量明显升高(P<0.05),表明IWR-1超过20μM浓度时,可导致成纤维细胞细胞膜损伤。3.IWR-1抑制成纤维细胞内源性Wnt/β-catenin信号通路KF的基础TOPflash活性与NF相比显著性增高,约为NF的2.5倍(P<0.01),IWR-1显著降低了 NF和KF的TOPflash荧光素酶活性,且具有浓度依赖性(P<0.05)。该结果证实IWR-1能抑制皮肤成纤维细胞Wnt/β-catenin信号传导。4.IWR-1抑制成纤维细胞增殖和迁移用细胞计数法描绘生长曲线检测IWR-1对细胞增殖的影响,在IWR-1作用第1、2、3天时,NF和KF细胞数与对照组相比明显减低(P<0.05),且具有浓度依赖性和时间依赖性,表明IWR-1显著降低了成纤维细胞增殖。细胞划痕实验结果显示在对照组中,培养24h后划痕区域几乎被迁移的细胞完全覆盖,而IWR-1处理组划痕区域迁移细胞数量明显减少且具有浓度依赖性,IWR-1组细胞迁移率与对照组比较差异有显著性(P<0.05),表明IWR-1处理可显著降低NF和KF的细胞迁移。5.IWR-1抑制成纤维细胞胶原生成IWR-1作用于NF和KF后,Ⅰ型胶原(α1和α2)蛋白表达水平与对照组相比明显减少,且具有剂量依赖性和时间依赖性;IWR-1明显降低了培养液中Ⅰ型前胶原C-肽(PICP)释放量(P<0.05),表明IWR-1可降低Ⅰ型胶原合成。6.IWR-1抑制成纤维细胞介导的胶原收缩作用胶原凝胶收缩分析实验结果显示,对照组胶原凝胶收缩具有时间依赖性,IWR-1对NF和KF的胶原收缩均具有明显的抑制作用,7天后对照组胶原块明显小于IWR-1组(P<0.05),表明IWR-1能显著抑制成纤维细胞介导的胶原收缩作用。7.IWR-1对TGF-β/Smad通路的影响和抑制肌成纤维细胞分化机制TGF-β1显著升高Smad2/3的磷酸化蛋白表达,但IWR-1没有抑制TGF-β1诱导的磷酸化Smad2/Smad3的蛋白水平,表明IWR-1抑制成纤维细胞胶原表达可能与TGF-β/Smad信号通路无关。KF中α-SMA的表达量显著高于NF,但是IWR-1并没有降低α-SMA表达量。罗丹明标记的鬼笔环肽荧光染色结果显示,KF的应力纤维数量比NF高,TGF-β1刺激后NF和KF应力纤维数量急剧增加,IWR-1显著削弱了 TGF-β1诱导的应力纤维生成,表明IWR-1能通过抑制应力纤维生成来抑制肌成纤维细胞分化。8.IWR-1上调成纤维细胞MMPs基因表达并增加MMP活性IWR-1显著上调了 MMP-1、MMP-3和MMP-13蛋白表达和mRNA表达水平,培养液中分泌的MMP蛋白表达量亦显著增加,尤其是MMP-13。凝胶酶谱分析法结果显示IWR-1增加了 MMP活性,尤其是较低分子量的MMP-13。结论:1.在NF和KF中,IWR-1可抑制成纤维细胞增殖和迁移,抑制胶原生成,包括胶原蛋白表达和细胞外基质mRNA水平;2.IWR-1可抑制成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩,显著减少TGF-β1诱导的应力纤维数量,从而抑制肌成纤维细胞分化;3.IWR-1可抑制NF和KF内源性Wnt/β-catenin信号通路;4.IWR-1抑制皮肤成纤维细胞胶原生成的机制可能不依赖Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号传导通路的相互作用;5.IWR-1能显著上调成纤维细胞MMPs的基因表达并增加MMP活性,从而促进胶原蛋白的降解。