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当病原体入侵时,机体能够快速产生强大的先天免疫应答,其中干扰素信号通路最为经典。目前,根据干扰素的来源、核苷酸和氨基酸序列、结构、受体以及生物学功能的不同,将其分为Ⅰ型干扰素（IFN-α/β）、Ⅱ型干扰素（IFN-γ）以及Ⅲ型干扰素（IFN-λ）。Ⅲ型干扰素是近年来新发现的一类干扰素。进一步研究表明其生物学功能和信号通路与Ⅰ型干扰素较为相似,首先与IFN-lR1和IL-10R2组成的受体复合物结合后,激活Jak-STAT信号通路,诱导大量干扰素刺激基因表达。由于Ⅲ型干扰素特异性受体IFN-lR1在上皮细胞和组织的大量表达,研究表明Ⅲ型干扰素在粘膜表面发挥着比Ⅰ型干扰素更特异的抗病毒功能。猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）感染是一类致死率极高的烈性传染病,具体症状表现为仔猪腹泻,在世界范围内广泛流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。肠道上皮细胞是其感染的主要靶细胞。本文首次对藏猪的IFN-λ3基因进行克隆、原核表达、并研究其对猪轮状病毒的抗病毒活性。1.藏猪IFN-λ3基因克隆及生物信息学分析根据GenBank中猪IFN-λ3基因序列（登录号:NM001166490）设计引物,采用RT-PCR方法从藏猪肠道和肺脏中扩增出其IFN-λ3基因（ZPoIFN-λ3）,将藏猪IFN-λ3基因克隆至pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-ZPoIFN-λ3。使用生物信息学软件分析,藏猪IFN-λ3核酸序列与野猪核酸同源性为100%,完整ORF全长588bp。藏猪的IFN-λ3基因编码蛋白共有23个氨基酸信号肽和172个氨基酸的成熟肽。藏猪IFN-λ3编码的氨基酸序列含有13个磷酸化位点、5个糖基化位点,其中1个为N-糖基化位点,4个O-糖基化位点。藏猪IFN-λ3的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。2.藏猪IFN-λ3成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测以pMD19-T-ZPoIFN-λ3质粒为模板,克隆藏猪IFN-λ3成熟肽基因（pMD19-T-mZPoIFN-λ3）,构建原核表达载体pET-32a（+）-mZPoIFN-λ3,于大肠杆菌BL21（DE3）中表达,成功表达大小约为34KDa的目的蛋白,并对诱导时间、IPTG浓度进行了优化。通过超声波破碎获得的包涵体经过镍柱亲和层析后,SDS-PAGE显示蛋白为单一条带。纯化蛋白经过透析复性浓缩,以此为免疫原制备鼠抗ZPoIFN-λ3多克隆抗体,经Western Blotting鉴定,证明获得的目的蛋白具有良好的免疫原性。采用细胞病变抑制法测定蛋白在MDBK/VSV的活性,结果显示pET-32a（+）-mZPoIFN-λ3表达蛋白在MDBK/VSV系统的抗病毒效价为10×24.5IU/0.1mL,比活力为2×103IU/mg。3.藏猪IFN-λ3抗猪轮状病毒活性研究将ZPoIFN-λ3原核表达产物以0、10、100、1000ng/mL的剂量预处理IPEC-J2细胞和MA104细胞24h后,接种0.1MOI PoRV SC-R株,于接种后36h收集细胞悬液。或以100ng/mL的剂量预处理MA104细胞24h后,于接种0.1MOI PoRV SC-R株后12h、24h和36h收集细胞悬液。Q-PCR检测样品中PoRV VP6基因的mRNA水平,结果显示不同剂量的原核表达产物在病毒接种IPEC-J2细胞和MA104细胞后均能有效地抑制PoRV SC-R株的增殖,并呈现一定的剂量和时间依赖,且低浓度的ZPoIFN-λ3（100ng/mL和10ng/mL）在IPEC-J2细胞的抗PoRV活性显著强于在MA104细胞的活性,高浓度（1000ng/mL）则差异不显著。为了探究ZPoIFN-λ3与猪IFN-α联合应用能否增强其抗病毒活性,以0、0.1、1、10ng/mL ZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL猪IFN-α单独或者联合IFN-α+ZPoIFN-λ3（10IU/mL+0.1ng/mL,100IU/mL+1ng/mL,1000IU/mL+10ng/mL）预处理IPEC-J2细胞24h,接种0.01MOI PoRV SC-R株,于接种后36h收集细胞悬液,反复冻融三次后,以TCID50测定病毒滴度。结果显示所有剂量二者联合应用均没有ZPoIFN-λ3单独应用抑制PoRV SC-R株增殖的活性强。为探究其中机制,相对荧光定量测定下游抗病毒蛋白MxA,OASL和ISG15转录情况,发现单独使用ZPoIFN-λ3诱导的下游抗病毒蛋白转录均高于二者联合应用。