研究目的:　　随着人口老龄化世界范围内加剧，慢性疾病如高血压病、脑卒中等发病率急剧增加，预计到2050年，痴呆的患病率将增加三倍。数十年前出现了痴呆的“阿尔茨海默症”，将所有认知功能下降等痴呆归于阿尔茨海默病。血管因素与痴呆关系成为近期研究的热点。血管性认知功能障碍(vascular cognitive impairment，VCI)顾名思义痴呆与血管因素相关，即血管或血管相关因素引起的认知功能下降。其范围包括血管性痴呆、非痴呆型VCI和混合型痴呆等，可单独发生或合并阿尔茨海默病。反复脑缺血再灌注损伤是主要病因之一，其机制包括血管因素、神经变性、神经递质、基因等多个方面，目前尚无明确的治疗方法。2012年，卒中进展评估组(NINDS)将“预防VCI”列为重点研究内容。截止目前用于VCI认知功能改善的药物也仅是沿用治疗AD的药物，因此寻求有效的治疗方法成为当前医学界的热点。　　远隔缺血处理(remote ischemic conditioning，RIC)即给予器官短暂非致死性的轻度缺血刺激，通过短暂的缺血-再灌注（ischemia-reperfusi on，IR）后，激活体内相关机制，使被保护的远隔脏器耐受较长时间缺血损伤。RIC在临床上应用为无创加压双上肢或双下肢，血流暂时阻断，是一种安全、无创、简便易行、成本低廉的治疗手段。众多研究表明RIC可能通过激活免疫、体液、神经和基因等复杂生物级联反应，发挥对远隔重要脏器的保护功能。各种脏器保护手术及相关临床、基础试验已证实其保护作用。　　RIC神经保护机制是多方面的，涉及相关神经递质、腺苷、炎症因子、细胞代谢、自噬溶酶体的激活、DNA修复及重塑机制激活、抑制细胞凋亡、保护血脑屏障和血管重塑、一氧化氮相关信号通路等。RIC能够调动机体内源性自我保护机制，有效减轻脑缺血损伤，但尚无研究报告其作用机制是否与调节自噬有关。本研究通过建立血管认知功能障碍模型及远隔缺血处理后，研究远隔缺血处理后VCI模型中自噬表达情况。　　自噬是细胞内存在大量长寿蛋白及功能损害的细胞器时，由溶酶体介导激活降解此类长寿蛋白质及受损细胞器，并循环再利用，是细胞自我清理调整、维持稳态的过程。脑缺血再灌注后产生大量活性氧自由基，诱导线粒体损伤，积聚大量功能异常的蛋白质及受损的细胞器，从而激活自噬，调节细胞稳态。自噬有细胞保护作用。自噬在缺血、缺氧前预处理时被适度激活发挥神经保护作用。微管相关蛋白1轻链(MAP1-LC3)是哺乳动物自噬体形成相关蛋白，细胞发生自噬时，细胞内LC3含量增加，LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ增多。能量及营养感受器哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是自噬的负调控因子。最近研究发现，糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）可通过调控mTOR的磷酸化调节自噬，调节细胞稳态。在缺氧、缺血前行远隔缺血处理和给予辛伐他汀预治疗24h，发现Beclin1表达上调及脑损伤减轻。在远隔缺血预处理时PI3K-Akt-mTOR通路激活后，自噬激活发挥细胞保护作用。短暂性缺血预处理局灶性脑缺血大鼠后，体内自噬体数量和LC3-Ⅱ水平持续增高，自噬时间延长，梗死体积缩小。调控自噬作用可能是RIC治疗VCI的机制之一。　　国内外学者在RIC治疗心脑血管疾病方面开展了一些研究，动物实验发现RIC可以提高VCI大鼠动物模型的脑血流量，减轻炎症反应及神经细胞变性坏死，改善认知功能，减少白质髓鞘脱失。但RIC对VCI的临床疗效及其病理机制尚不明确。我们在利用RIC方法治疗脑梗死的过程中发现患者的认知功能改善，包括脑梗死急性期及恢复期的患者。所以，我们提出RIC可以有效改善VCI的认知功能障碍这一设想。其机制可能是通过调控自噬、PI3K/Akt、MAPK、VEGF等通路实现的。　　综上所述，我们拟对VCI患者及小鼠模型进行RIC治疗，探讨其可能的病理机制，检测RIC后自噬相关蛋白表达情况，在脑缺血损伤中RIC与自噬的相关性及相互作用，RIC能否通过激活自噬发挥脑保护作用。本研究将为RIC治疗VCI提供理论及实践基础，如能取得预期效果，应用于临床的时间不会太久，具有重要理论意义和潜在的临床应用价值。　　研究方法:　　将健康雄性C57BL/6J小鼠随机分为三组:假手术组（sham组）、模型对照组（BCAS组）及模型-远隔缺血处理组(BCAS+RIC组)。　　1、双侧颈总动脉结扎法建立VCI小鼠模型，利用Morris水迷宫记录各组小鼠行为学及运动轨迹。7、28d定位航行试验及空间探索试验观察记忆、定向等行为学习及认知功能。　　2、小鼠脑缺血后持续间断给予RIC刺激，对缺血后7、28d脑白质及海马进行HE染色，观察各组小鼠脑白质及海马病理改变及神经元凋亡情况。　　3、动态检测缺血处理后不同时间自噬在RIC中的作用，采用western blot技术观察远程缺血处理后VCI发病过程中ATG7、Beclin-1、LC3、Atg5-Atg12蛋白水平的动态变化。RT-PCR检测自噬相关蛋白基因BECN1、Atg5、Atg7表达情况。　　研究结果:　　实验动物行为学上，sham组小鼠空间探索能力及潜伏期高于BCAS组及BCAS+RIC组。根据定位航行实验潜伏期及空间探索实验穿平台次数测定小鼠学习及认知能力。定位航行实验潜伏期越短，空间探索实验中穿过平台次数越多提示学习及认知能力越强。各组小鼠逃避潜伏期时间随着训练天数增加逐渐缩短。BCAS组及BSAS+RIC组小鼠逃避潜伏期较sham组延长，BSAS+RIC组成绩更优于BCAS组，但两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。第7天空间探索实验中，与sham组比，BCAS组及BCAS+RIC组穿越平台次数减少，BSAS+RIC组成绩优于BCAS组，比较两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。第28天空间探索实验中，与sham组比，BCAS组及BCAS+RIC组穿越平台次数减少，BCAS+RIC组穿越平台次数优于BCAS组。靶象限时间占总时间的百分比:sham组(33.8％)，BCAS组(17.34％)，BCAS+RIC组(20.56％)。游泳轨迹中，与sham组相比，BCAS组小鼠呈现杂乱无章的平台搜索轨迹，BCAS+RIC组较BCAS组呈现一定的规律性。从均值分析能够大概看出各组小鼠学习及认知能力变化趋势（双侧颈动脉狭窄严重影响小鼠认知能力，远隔缺血后适应对BCAS导致的损伤有一定的改善作用），但是BCAS及BCAS+RIC组数据之间无显著性差异，这一结果可能与动物间个体化差异及实验样本数不足有关。Western blot检测结果分析:根据实验结果可以看出，相比于假手术组(sham)，双侧颈总动脉狭窄(BCAS)能够上调小鼠白质及海马组织中ATG7、Beclin-1、LC3、Atg5-Atg12蛋白水平的表达，下调白质及海马组织中p62蛋白的表达。而BCAS+RIC能够进一步促进小鼠脑白质及海马组织中相应蛋白的变化。细胞自噬过程中的关键蛋白Beclin-1、LC3、ATG7、Atg5-Atg12，随细胞自噬水平增加蛋白表达水平上调;p62为细胞自噬底物蛋白，与自噬呈负相关。根据上述研究结果可以看出，双侧颈总动脉狭窄能够激活模型小鼠脑白质及海马组织中的细胞自噬，在远隔缺血处理后，自噬相关蛋白表达增强，自噬水平进一步增高。Real-time PCR检测结果分析:从结果可以看出，BCAS组小鼠脑白质及海马组织中自噬关键基因BECN1、Atg5、Atg7的水平均高于sham组，远隔缺血处理组（BCAS+RIC）进一步诱导脑白质及海马区上述基因mRNA水平的表达。　　研究结论:　　我们实验发现远隔缺血处理可以改善VCI小鼠认知功能。通过基因检测及蛋白表达检测进一步证实双侧颈总动脉狭窄后小鼠脑组织细胞自噬水平升高，远隔缺血处理可进一步诱导细胞自噬。提示远隔缺血处理可能通过激活自噬来发挥VCI的神经保护作用，减轻认知功能损害。然而远隔缺血处理激活诱导自噬途径及具体机制有待进一步研究。动物实验发现RIC可以提高VCI大鼠动物模型的脑血流量，减轻炎症反应及神经细胞变性坏死，改善认知功能，减少白质髓鞘脱失。远隔缺血处理以双上肢或双下肢无创血压计加压暂时阻断血流的方式应用于临床。这种疗法可以应用于人类，如果成功的话，这种使用无创血压计加压疗法将是一种“运动等效”方法，对于老年患者以及护理人员来说是非常方便的，因此可以改变目前VCI在人类中的治疗模式。