【摘 要】
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胆固醇是昆虫细胞代谢生长及激素合成的重要物质,但昆虫自身不能合成该类物质,需要从植物或其它食物中获取,控制昆虫胆固醇吸收转化可能是害虫防治的一种新途径。昆虫体内参与吸收、转运和代谢植物固醇的基因相对比较保守,NPC1是其中关键基因之一,绝大部分昆虫有2个NPC1基因,而烟粉虱等少数昆虫基因组中仅有1个NPC1基因,分析探讨该基因序列及功能可为这一重要的农业害虫防治提供新的理论参考。本文以烟粉虱为研
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胆固醇是昆虫细胞代谢生长及激素合成的重要物质,但昆虫自身不能合成该类物质,需要从植物或其它食物中获取,控制昆虫胆固醇吸收转化可能是害虫防治的一种新途径。昆虫体内参与吸收、转运和代谢植物固醇的基因相对比较保守,NPC1是其中关键基因之一,绝大部分昆虫有2个NPC1基因,而烟粉虱等少数昆虫基因组中仅有1个NPC1基因,分析探讨该基因序列及功能可为这一重要的农业害虫防治提供新的理论参考。本文以烟粉虱为研究对象,根据其基因组数据中NPC1基因的序列,PCR扩增该基因全长,分析其表达情况,通过植物叶片介导ds RNA的RNA干扰（RNAi）和抑制剂的方法研究该基因的功能,主要研究结果如下:（1）根据NCBI数据库和烟粉虱基因组数据库得到的基因序列,利用Primer5.0引物设计软件设计扩增引物,经PCR扩增获得该基因的多片段c DNA序列,拼接后得到完整c DNA序列,推测蛋白序列3个保守结构域完整,序列比对及进化分析显示与昆虫纲其它NPC1基因高度一致。（2）NPC1基因在烟粉虱中有差异表达。实验分别选取烟粉虱的不同隐种（B型烟粉虱、Q型烟粉虱、ZHJ-1型烟粉虱）、不同龄期（卵、1-2龄若虫、3龄若虫、4龄若虫、雌成虫、雄成虫）和不同部位（头部、胸部和腹部）,提取RNA反转录,进行荧光定量PCR,结果显示NPC1基因在烟粉虱B型、Q型和ZHJ-1型三种生物型中均有表达,但是表达量没有差异。NPC1基因在烟粉虱各个发育阶段都有表达,在雄成虫和雌成虫中表达量较高,在1-2龄、3龄和4龄中的表达量较低。NPC1基因在烟粉虱各个部位都有表达,在腹部中表达量最高。（3）采用植物叶片介导dsRNA进行RNA干扰实验。结果显示ds NPC1处理烟粉虱成虫后,相对ds EGFP对照其NPC1基因下调66%,ds NPC1处理烟粉虱成虫后的产卵量与对照相比显著减少,成虫的存活率显著下降。ds NPC1处理烟粉虱若虫后,和对照组相比,NPC1基因下调39%,若虫的存活率显著下降。（4）采用双膜法研究胆固醇及胆固醇抑制剂对烟粉虱的影响。NPC1基因表达受胆固醇浓度影响,烟粉虱成虫饲喂1 mg/m L胆固醇,其NPC1基因的表达量显著高于0.25mg/m L、0.5 mg/m L和2 mg/m L胆固醇的表达量,而且烟粉虱在0.25 mg/m L、0.5 mg/m L、1 mg/m L胆固醇NPC1表达量随着胆固醇浓度的增加而递增。胆固醇浓度影响烟粉虱存活率,饲喂0.25 mg/m L、0.5 mg/m L、1 mg/m L和2 mg/m L胆固醇后,烟粉虱的存活率随着胆固醇浓度的增加而递增。胆固醇抑制剂抑制烟粉虱NPC1基因表达,其基因表达量随着胆固醇抑制剂浓度的增加而降低,且U18666A处理的表达量低于ezetimibe处理的表达量。烟粉虱存活率随着胆固醇抑制剂浓度的增加而显著减少,且U18666A处理的烟粉虱的存活率显著高于ezetimibe处理的烟粉虱的存活率。
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