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背景心血管疾病是全球范围内造成死亡的最主要原因。大量流行病学研究表明,心血管疾病与空气颗粒(particulate matter, PM)污染物暴露有关。各种PM对心血管系统损伤很大,而且颗粒物体积越小,危害性越大。多壁碳纳米管(MWCNTs)是属于纳米级颗粒,主要应用于纳米线圈、电子元件、催化剂等,并逐渐发展到药物载体等生物医药领域,其心血管暴露的机会增加,但目前对其生物安全性评价主要集中于肺毒性的研究。研究表明MWCNTs诱发肺部和/或全身的炎症反应,并使血管血红素氧合酶(heme oxygenase-1, HO-1)基因活化及氧化损伤,可能引起血管内皮功能损伤,形成前凝聚状态,具有一定的心血管系统毒性效应。内皮损伤是血管病理改变的主要早期事件,最终可引起一系列心血管相关的疾病。我们前期的研究表明,MWCNTs可引起内皮细胞发生DNA损伤和凋亡。本课题用体内外实验相结合的方法,研究MWCNTs对内皮损伤的机制,为后期的实验奠定基础。在明确MWCNTs对内皮的损伤作用之后,采用SD大鼠高脂饮食诱发动脉粥样硬化模型,观察MWCNTs的心血管系统毒性。考虑到肺部炎症和脂肪肝程度都与心血管系统密切相关,所以,除了观察心脏、主动脉和血液,还有肺脏和肝脏。为了进一步验证MWCNTs对AS的影响,并且比较其他碳纳米材料的影响程度,本项目采用典型的高脂饮食LDLR-1小鼠高脂饮食诱发高脂血症模型,比较研究了单壁碳纳米管(SWCNTs)、MWCNTs和多壁碳纳米圈(MWCNOs)的心血管毒性。目的、方法和结果1为了研究MWCNTs对内皮细胞结构和功能的改变情况,进行了体内实验和体外实验。其中体内实验把1%Tween 80作为溶剂对照组,200μg/kg单壁碳纳米管和1 mg/kg脂多糖作为阳性对照组,观察200μg/kg MWCNTs连续静脉注射7 d后,利用免疫组化和western blot测定内皮细胞vWF的表达情况；用ELISA测定血浆中的vWF和sICAM-1,综合评价内皮细胞的损伤情况。体外实验把完全培养液作为溶剂对照组,观察各浓度的MWCNTs对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作用不同时间后,利用电阻仪测定内皮细胞的电阻,western blot测定内皮细胞ZO-1的表达情况,评价内皮细胞的功能性损伤；利用台盼蓝试验测定细胞活力；western blot测定内皮细胞procaspase-3、活化的caspase-3、p62和Atg8蛋白,评价内皮细胞损伤的机制。结果表明：200μg/kg MWCNTs连续静脉注射SD大鼠7d后,内皮细胞vWF表达增加,并分泌进入血液,造成内皮功能性和结构性损伤,导致血液中sICAM-1水平降低(P<0.05)；不同浓度的MWCNTs作用于人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 0-48h, TEER降低,并有时间和浓度依赖效应；不同浓度的MWCNTs处理24 h后,ZO-1蛋白表达降低,内皮细胞的通透性增加(P<0.05),细胞活力降低,procaspase-3、活化的caspase-3、p62三个蛋白表达降低,而LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的转化升高(P<0.05)。2为了研究50、100和200μg/kg多壁碳纳米管(MWCNTs)连续处理高脂饮食SD大鼠1-4个月后对血液、心、主动脉、肝和肺的影响,HE染色观察心、主动脉、肝和肺部的病理情况；油红O染色和茜素红染色分别观察主动脉内膜脂质沉积和主动脉钙化；用各个试剂盒测定血清和肝中的CHOL、TG和HDL-c,反映血脂和肝中脂类的情况,测定血清和肝中的GSH、MDA和T-SOD,反映氧化情况,测定血清和肝中的GOT、GPT和γ-GT,反映肝功；荧光定量PCR测定肺部炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA水平。结果表明：MWCNTs升高血清中的TG水平；50、100和200μg/kg MWCNTs作用2-4个月,主动脉内膜脂质沉积面积增加,肺间隔不同程度增厚,形成大小不同的肺肉芽肿块,GOT、GPT、γ-GT、GSH、T-SOD和MDA受到不同程度影响,肝中的脂类发生变化；50、100、200μg/kg MWCNTs作用2或4个月,主动脉钙化程度加重。3进一步验证MWCNTs对动脉粥样硬化的影响,并与SWCNTs和MWCNOs进行比较。分别用SWCNTs(2 mg/kg)、MWCNTs(2 mg/kg)和MWCNOs(20 mg/kg)分别处理高脂饮食LDLR-1小鼠3个月后,用HE染色观察心、主动脉、肺、肝和脾的病理情况；用各个试剂盒测定血清中的CHOL、TG、LDL-c和HDL-c,反映血脂的情况；用各个试剂盒测定血清中的GSH、MDA和T-SOD,反映氧化情况；用各个试剂盒测定血清中的GOT、GPT和y-GT,反映肝功。结果表明：SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs都使肺间隔增厚,肺部肉芽肿形成,但MWCNTs在肺部蓄积更多,使肺脏系数增大(P<0.01),形成更多更大的肉芽肿；MWCNTs和MWCNOs使心脏系数和脾脏系数明显降低；SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs都使血脂降低,主动脉脂肪变程度降低；SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs对脂肪肝病变的影响并不显著；SWCNTs、MWCNTs和MWCNOs使血清中的GSH下降的幅度不同；MWCNTs和MWCNOs使肝功受到影响。结论1多壁碳纳米管使内皮发生功能性和结构性损坏。2多壁碳纳米管加重动脉粥样硬化。3单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和多壁碳纳米圈都降低血脂。