【摘 要】
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目的:探讨在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中结直肠肿瘤差异表达基因（colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE）的表达情况以及CRNDE对于AML细胞增殖、周期和凋亡的作用及其分子机制。方法:1.使用生物信息学软件GEPIA对TCGA数据库中的数据进行统计分析,探究CRNDE在AML患者骨髓中的表达
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目的:探讨在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）中结直肠肿瘤差异表达基因（colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE）的表达情况以及CRNDE对于AML细胞增殖、周期和凋亡的作用及其分子机制。方法:1.使用生物信息学软件GEPIA对TCGA数据库中的数据进行统计分析,探究CRNDE在AML患者骨髓中的表达情况。QRT-PCR检测AML细胞中CRNDE表达水平。2.使用生物信息学软件Lnc Locator分析CRNDE的亚细胞定位。3.转染敲低CRNDE的慢病毒至U937和KG-1a细胞中,得到稳定低表达CRNDE的U937和KG-1a细胞株。利用CCK-8和细胞计数试验测定增殖能力;再利用流式细胞术和WB试验测定细胞凋亡和周期分布。通过qRT-PCR、WB法检测CRNDE对下游靶基因miR-136-5p和MCM5表达的作用情况。4.QRT-PCR检测AML细胞中miR-136-5p和MCM5的表达水平。转染miR-136-5p mimic和miR-136-5p inhibitor至U937和KG-1a细胞中,CCK-8测定细胞增殖;流式细胞术测定凋亡和周期分布。通过qRT-PCR、WB法检测miR-136-5p对CRNDE和MCM5表达水平的调控情况。5.生物信息学软件Starbase V2.0预测CRNDE与miR-136-5p的结合位点。构建CRNDE野生型（CRNDE-Wt）及CRNDE突变型（CRNDE-Mut）质粒,分别与miR-136-5p mimic/NC mimic共转染。双荧光素酶试验验证二者之间的结合位点。RIP试验检测AGO2抗体对于CRNDE的富集作用。6.生物信息学软件Targetscan 7.0预测得到MCM5和miR-136-5p之间的结合位点。构建MCM5 3’UTR野生型（MCM5-3’UTR-Wt）和突变型（MCM5-3’UTR-Mut）质粒,分别与miR-136-5p mimic/NC mimic共转染。双荧光素酶试验验证二者之间的结合位点。7.在敲低CRNDE的稳转株细胞中转染miR-136-5p inhibitor,通过qRT-PCR和WB检测MCM5表达的变化。结果:1.CRNDE在AML患者骨髓以及AML各细胞系中表达上调。2.分析结果显示CRNDE主要定位于胞质溶胶。3.敲低CRNDE可以抑制AML细胞增殖,促进凋亡,使周期阻滞在G1期。也会上调miR-136-5p,下调MCM5核酸及蛋白水平表达。4.MiR-136-5p在AML各细胞系中呈现低表达状态,而MCM5则高表达。过表达miR-136-5p抑制AML细胞增殖,促进凋亡,阻滞周期于G1期;还可以下调CRNDE m RNA和MCM5 m RNA及蛋白水平表达;抑制miR-136-5p则会产生相反的调控作用。5.经Starbase V2.0分析和双荧光素酶试验的验证,结果显示CRNDE与miR-136-5p之间存在直接结合作用。RIP试验结果发现相比于IgG组,AGO2抗体组富集产物中含有更多CRNDE。6.经Targetscan 7.0分析和双荧光素酶试验的验证,结果显示MCM5和miR-136-5p之间存在结合作用。7.抑制miR-136-5p可以在核酸和蛋白水平逆转敲低CRNDE导致的MCM5表达下调。结论:1.CRNDE在AML患者骨髓以及各细胞系中高表达,主要定位于胞质溶胶,发挥促癌作用。2.AML细胞中,miR-136-5p低表达且发挥抑癌作用。3.CRNDE作为miR-136-5p的内源性竞争性RNA,从而调控MCM5的表达。
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