第一部分注射用前列地尔对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响目的:观察注射用前列地尔对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响,并初步探讨其作用机制。方法:(1)选用健康雄性SD大鼠,随机分为4组:假手术组(Sham组),心肌缺血/再灌注模型组(I/R组),前列地尔低剂量组(Alprostadil 4μg/kg),前列地尔高剂量组(Alprostadil 8μg/kg)。(2)结扎大鼠左冠状动脉前降支使其缺血30min,再灌注24h,制备心肌缺血/再灌注损伤模型。再灌注24h后检测血清肌钙蛋白T(Troponin T)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及乳酸脱氢酶(LDH)水平、NBT法检测心肌梗死面积、应用超声心动图检测大鼠心功能(再灌注72h)、在光镜及电镜下观察心肌组织形态学特点、TUNEL原位标记法和DAPI双重染色检测大鼠心肌细胞凋亡、检测心肌组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)及过氧化氢酶(CAT)活性。结果:(1)与Sham组相比,模型组血清Troponin T、CK-MB及LDH均增高,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,前列地尔4或8μg/kg组血清Troponin T、CK-MB及LDH均降低,其中8μg/kg组与模型组相比有统计学差异(p<0.05)。(2)与Sham组相比,模型组心肌梗死面积增加,差异有统计学意义(p<0.01);与模型组相比,应用注射用前列地尔4或8μg/kg均可减少心肌I/R造成的心肌梗死面积增加,差异均有统计学意义(p<0.01)。(3)超声心动图检测了LVIDd、LVIDs、EF。与Sham组相比,模型组大鼠心功能损害加重,表现为LVIDd和LVIDs增大(p<0.01)、EF降低(p<0.05)。与模型组相比,应用注射用前列地尔4或8μg/kg均可改善大鼠心功能,表现为LVIDd和LVIDs减小、EF增加,其中8μg/kg组与模型组相比差异有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。(4)心肌组织病理学形态:HE染色后光镜下观察左室心肌组织,发现与模型组相比,应用前列地尔组大鼠表现出轻度心肌细胞坏死和心肌间质水肿,伴随着较少的中性粒细胞浸润,尤以8μg/kg组改善更为显著。电镜下观察心肌细胞,模型组大鼠心肌细胞细胞核和线粒体都发生了严重损伤,表现为心肌肌节纤维排列紊乱,肌丝溶解、断裂、Z线不清;线粒体肿胀;染色质浓缩、沿核膜呈周边性排列,形成大小和形状不一的碎片及块状。应用前列地尔组心肌结构较模型组有所改善,尤以8μg/kg组更为显著。上述结果说明心肌缺血/再灌注可以引起大鼠心肌细胞凋亡,发生凋亡特征性的形态学改变,高剂量前列地尔的应用可显著减轻心肌细胞凋亡程度。(5)TUNEL和DAPI染色及凋亡指数的结果显示,与Sham组相比,模型组心肌组织凋亡指数显著增高(p<0.01)。与模型组相比,前列地尔4或8μg/kg组均可减少细胞凋亡,凋亡指数与模型组相比均显著降低(p<0.01)(6)与Sham组相比,模型组心肌组织中MDA含量显著升高(p<0.01),SOD和CAT活性显著降低(p<0.05)。与模型组相比,前列地尔4或8μg/kg组的MDA含量均降低,SOD和CAT活性均增高,其中8μg/kg前列地尔组与模型组相比有统计学差异(p<0.05)。小结:注射用前列地尔可以减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤,高剂量组比低剂量组效果更为显著,表现为减少心肌梗死面积、降低血清心肌酶学水平、改善心功能。其作用机制与抗细胞凋亡、抗氧化应激有关。第二部分注射用前列地尔对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用机制研究目的:探讨注射用前列地尔减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用机制,探讨PI3K/Akt信号通路在前列地尔心脏保护作用中发挥的作用。方法:(1)健康雄性SD大鼠,随机分为4组:心肌缺血/再灌注模型组(I/R组),前列地尔高剂量组(Alprostadil 8μg/kg),前列地尔高剂量+LY294002组(Alprostadil 8μg/kg+LY),LY294002组(I/R+LY)。(2)结扎大鼠左冠状动脉前降支使其缺血30min,再灌注24h,制备心肌缺血/再灌注损伤模型,模型制备方法同实验一。再灌注24h后检测血清Troponin T、CK-MB及LDH水平、NBT法检测心肌梗死面积、应用超声心动图检测大鼠心功能(再灌注72h)、在光镜及电镜下观察心肌组织形态学特点、TUNEL原位标记法和DAPI双重染色检测大鼠心肌细胞凋亡、检测心肌组织MDA含量、SOD及CAT活性,应用Western Blot检测心肌组织凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax的表达及Akt、p-Akt、e NOS、p-e NOS的蛋白表达,检测左心室心肌组织NO的含量,同时应用RT-PCR检测各组大鼠心肌组织TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白m RNA转录水平。结果:(1)与模型组相比,前列地尔高剂量组血清Troponin T、CK-MB及LDH均明显降低(p<0.05);与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组血清Troponin T、CK-MB及LDH水平显著增高,结果有统计学意义(p<0.05),说明前列地尔降低心肌缺血/再灌注损伤导致的心肌酶学指标升高的保护作用可被LY294002抑制。(2)与模型组相比,高剂量前列地尔可显著减少心肌梗死面积(p<0.01);与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组大鼠的心肌梗死面积显著增加,差异有统计学意义(p<0.01),表明前列地尔诱导的减少MIRI后心肌梗死面积的心脏保护作用可被LY294002抑制。(3)与模型组相比,高剂量前列地尔可改善大鼠心功能,表现为LVIDd和LVIDs减小、EF增加,差异均有统计学意义(p<0.05);与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组心功能明显较差,表现为LVIDd和LVIDs增大(p<0.05)、EF降低(p<0.05),显示LY294002可抑制前列地尔对心肌缺血/再灌注损伤大鼠的心功能保护作用。(4)心肌组织病理学形态:HE染色在光镜下观察左室心肌组织,发现与模型组相比,前列地尔高剂量组大鼠表现出轻度心肌细胞坏死和心肌间质水肿,伴随着较少的中性粒细胞浸润。与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组的心肌细胞坏死、水肿的程度加重。电镜下观察心肌细胞,模型组大鼠心肌细胞细胞核和线粒体都发生了严重损伤,表现为心肌肌节纤维排列紊乱,肌丝溶解、断裂、Z线不清;线粒体肿胀;染色质浓缩、沿核膜呈周边性排列,形成大小和形状不一的碎片及块状。与模型组相比,前列地尔高剂量组上述心肌细胞的损伤程度明显减轻;与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组的心肌细胞损伤程度加重。(5)TUNEL和DAPI染色及凋亡指数的结果显示,与模型组相比,前列地尔高剂量组大鼠的心肌细胞凋亡指数显著减少,差异有统计学意义(p<0.01)。与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组心肌细胞凋亡指数显著增高(p<0.01),说明前列地尔可以抑制心肌缺血/再灌注损伤导致的细胞凋亡,这种心脏保护作用可被LY294002阻断。(6)与模型组相比,前列地尔高剂量组大鼠心肌组织MDA含量降低,SOD和CAT的活性均增高,差异有统计学差异(p<0.05);与前列地尔高剂量组相比,前列地尔高剂量+LY294002组表现为MDA含量显著增高,SOD和CAT活性显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。表明高剂量前列地尔可抗氧化应激,这一作用可被LY294002阻断。(7)与模型组相比,高剂量前列地尔可促进大鼠心肌组织中Bcl-2的表达,同时抑制Bax和cleaved caspase-3的表达,差异有统计学意义(p<0.01)。与前列地尔高剂量组比较,前列地尔高剂量+LY294002组,Bcl-2表达降低(p<0.05),Bax和Caspase-3的表达均增加(p<0.01)。表明高剂量前列地尔的这一心脏保护作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断。(8)与模型组相比,高剂量前列地尔可促进大鼠心肌组织中Akt和e NOS的磷酸化(p<0.01),并促进缺血的心肌组织释放更多的NO(p<0.01)。与前列地尔高剂量组比较,前列地尔高剂量+LY294002组大鼠心肌组织Akt和e NOS的磷酸化程度下调,心肌组织中的NO水平降低(p<0.05)。表明前列地尔上调Akt和e NOS磷酸化进而促进NO生成的作用可被LY294002阻断。(9)与模型组相比,高剂量前列地尔可下调大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白m RNA转录水平(p<0.01),与前列地尔高剂量组比较,前列地尔高剂量+LY294002组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白m RNA转录水平均显著增高(p<0.01)。表明前列地尔抗炎性反应的作用可被LY294002阻断。小结:(1)注射用前列地尔通过PI3K/Akt/e NOS信号转导通路介导,上调磷酸化Akt水平,促进e NOS磷酸化及NO表达,以及上调Bcl-2、下调cleaved caspase-3和Bax的蛋白表达,发挥抗细胞凋亡、减轻心肌缺血/再灌注损伤的作用。(2)注射用前列地尔通过PI3K/Akt信号通路介导发挥抗氧化应激作用以减轻心肌缺血/再灌注损伤。(3)注射用前列地尔降低心肌I/R导致的TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白m RNA转录增加,通过抗炎性反应发挥其减轻心肌缺血/再灌注损伤的保护作用,也可能是通过降低TNF-α的蛋白表达,通过抑制依赖TNF受体家族的死亡受体途径,发挥抗凋亡作用而实现其减轻心肌缺血/再灌注损伤的心脏保护作用。PI3K/Akt信号通路介导了前列地尔的这一作用机制。第三部分人参皂苷Rg3对大鼠心肌缺血/再灌注损伤后心功能的影响及机制研究目的:建立在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型,探讨人参皂苷Rg3是否可以改善心肌缺血/再灌注导致的心功能损害,并探讨其作用机制。方法:(1)健康雄性SD大鼠,随机分为4组:假手术组(Sham组),心肌缺血/再灌注模型组(I/R组),人参皂苷Rg3低剂量组(5mg/kg),人参皂苷Rg3高剂量组(20mg/kg)。(2)结扎大鼠左冠状动脉前降支使其缺血30min,再灌注24h,制备心肌缺血/再灌注损伤模型,模型制备方法同实验一。再灌注24h后利用超声心动图检测大鼠心脏结构及功能,应用RM-6000多导生理记录仪测量血流动力学指标,TUNEL原位标记法及DAPI双重染色检测心肌细胞凋亡,Western Blot法检测各组大鼠心肌p53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的蛋白表达,ELISA法测定左心室心肌组织TNF-α和IL-1β的蛋白含量。结果:(1)超声心动图检测结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠的LVIDd和LVIDs均增加,FS和EF均显著降低(p<0.05或0.01)。与模型组相比,人参皂苷组可改善大鼠心功能,表现为LVIDd和LVIDs减小,EF和FS增加(p<0.05)。血流动力学指标检测结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠的心功能受损,表现为LVEDP显著增加而LVSP和±dp/dt显著降低(p<0.01)。与模型组相比,5或20 mg/kg人参皂苷Rg3均可抑制上述改变(小剂量组p<0.05,大剂量组p<0.01),说明人参皂苷可减轻心肌缺血/再灌注损伤导致的心功能受损。(2)TUNEL和DAPI染色结果显示,与Sham组相比,模型组大鼠的心肌凋亡细胞数目显著增加(p<0.01),与模型组比较,人参皂苷Rg3治疗组大鼠的心肌凋亡细胞数目则显著减少(5 mg/kg组p<0.05,20 mg/kg组p<0.01),说明人参皂苷Rg3具有抗细胞凋亡的作用。(3)Western Blot结果显示,与Sham组相比,模型组心肌组织中p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达增加(p<0.01),而Bcl-2蛋白的表达降低(p<0.01)。应用人参皂苷Rg3 5或20 mg/kg治疗均可降低p53、Bax和cleaved caspase-3蛋白的表达,同时提高Bcl-2的蛋白表达(p<0.05或p<0.01)。(4)与Sham组相比,模型组大鼠的左心室心肌组织的TNF-α和IL-1β水平增加,差异具有统计学意义(p<0.01)。5或20 mg/kg人参皂苷Rg3均可抑制上述改变,差异均有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。小结:(1)人参皂苷Rg3可改善大鼠心肌缺血/再灌注损伤所导致的心功能损害。(2)人参皂苷Rg3改善心肌缺血/再灌注损伤后心功能损害的作用机制与抗细胞凋亡及抗炎性反应作用有关。