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伪狂犬病(Pseudorabies, PR)又称Aujeszky’s病,其病原伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)是疱疹病毒科(Herpes viridae),α-疱疹病毒亚科(Alpha herpes viridae)的成员,基因组大小约150Kb,G+C含量高达73%,是一种线状双链DNA病毒。伪狂犬病可引起牛、羊及野生动物的发热、奇痒(除猪外)、脑脊髓炎等症状,猪是伪狂犬病毒(PRV)的天然宿主和主要感染源。伪狂犬病是世界性的重要传染病之一,给我国养猪业造成了巨大的经济损失,其危害仅次于猪瘟和口蹄疫。经研究发现，囊膜糖蛋白gB是伪狂犬病毒(PRV)的一个重要免疫原,能介导病毒与细胞间的相互作用,属于必需糖蛋白,也是疱疹病毒中最为保守的基因。gB糖蛋白作为动物机体免疫系统识别的主要靶抗原,在伪狂犬病诊断和根除计划中发挥着重要的作用。本研究选择伪狂犬病毒gB糖蛋白作为研究对象,利用DNAMAN和Oligo6.3软件对Genebank中登录的各伪狂犬病毒(PRV)gB基因序列进行分析,分别设计合成了3对特异性引物：一对不含酶切位点引物、一对荧光特异性引物和TaqMan探针、一对含有EcoRI和Xbal酶切位点引物。1、通过DNA/RNA提取试剂盒对PRV病毒进行DNA的提取,利用普通PCR技术获得了全长约2.8Kb的PRV-gB基因,并克隆至pMD20-T载体,成功构建了重组质粒pMD20-gB。通过基因测序和Genebank分析其生物学特性,最终鉴定本实验室所分离PRV毒株为南阳株(Namyangju)。2、将重组质粒pMD20-gB作为阳性标准品,利用荧光特异性引物和TaqMan探针建立了一种快速检测伪狂犬病毒的荧光定量PCR方法。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒(PRV) TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/应,相比于普通PCR方法其灵敏度高1000倍以上,并且重复性好。同时对60份临床样品的俭测,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。3、为获得大量的、成本较低的gB诊断抗原,本研究中用含有EcoRI和Xbal酶切位点的特异性引物,利用普通PCR技术以重组质粒pMD20-gB为模板,重新扩增gB基因全序列,成功构建了含gB主要杭原表位基因的Pichia酵母分泌表达载体pPICZαA-gB,并通过测序和DNAMAN软件分析表明该基因无突变,蛋白编码正确无误,可继续试验。选择Pichia酵母X-33株感受态细胞转化克隆重组表达质粒pPICZαA-gB,30℃温箱培养一周左右,取单菌落液体培养,提取酵母基因组进行PCR鉴定,结果表明本研究成功获得了可分泌表达PRV-gB主要杭原表位基因的重组菌。经1%甲醇诱导表达蛋白,通过SDS-PAGE检测目的蛋白大小约为103KD。同时研究了目的蛋白表达量与各个培养条件的关系,优化后的最佳表达条件为：诱导初期的培养液所含菌体浓度OD600值为1.2,28.8℃摇床剧烈震荡,每24h补加甲醇终浓度为1%,诱导表达时间为72h,蛋白表达量达最大值。在最佳表达条件下所诱导表达的重组蛋白经纯化后含量达8.715mg/mL。4、将以上浓缩纯化后的重组蛋白gB作为抗原进行包被,制备ELISA抗体检测板,对PRV-gB阳性／阴性血清进行间接ELISA检测。结果显示,此目的蛋白具有很好的反应原性,可作为检测用抗原。利用己建立的gB-ELISA方法对猪瘟、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征的阳性血清进行试验,结果表明gB蛋白与其他病毒阳性血清无交叉反应,有较好的特异性,可以用于PRV-aB蛋白抗体的检测。将gB抗原免疫新西兰大白兔,通过琼脂扩散试验和中和试验测得血清抗体效价平均达到1：8,说明了gB蛋白具有很好的免疫原性。对已达到一定抗体水平的兔子采血,收集血清制备gB抗血清,为规范诊断检测试剂和实验室质量控制提供一定的物质基础。