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研究目的:甲硫腺苷(S-Methyl-5’-thioadenosine,MTA)是蛋氨酸代谢的产物,以往研究表明,其在癌症、炎症、细胞增殖等过程中发挥了重要的作用。本课题组前期工作发现,体内关键的促炎症消退介质脂氧素A4(Lipoxin A4,LXA4)能通过改变肿瘤炎症和缺氧微环境,从而抑制肝癌细胞的生长。本课题中,我们进一步研究了LXA4对缺氧状态下肝癌细胞代谢的影响,尤其是对MTA及其相关化合物代谢的调节作用。研究方法:(1)体外培养Hep G2人肝癌细胞株,将其分为4组,C1、C2为常氧组,细胞在常氧条件下进行培养;T1、T2为缺氧组,细胞在含1%O2的缺氧培养箱中培养。C1、T1组细胞每ml培养基中加入0.7ul的无水乙醇作为溶剂对照,C2、T2组细胞在培养基中加入200n M LXA4,细胞处理36小时后观察后续指标。(2)代谢组学分析:a.使用提取液(甲醇:乙腈:水=2:2:1)提取Hep G2细胞,然后置于液氮中冻存。b.反复冻融以破碎细胞,每次冻融过程中伴随一次超声破碎,离心去除其中不溶的杂质,低温真空干燥剩余上清液,其后使用乙腈水溶液复溶(乙腈:水=1:1)。c.采用高效液相色谱质谱联用(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)方法对样品进行代谢组学分析。(3)HPLC-MS实验检测细胞内MTA及其相关化合物含量:a.采用反复冻融法破碎Hep G2细胞,提取细胞内的MTA及其相关化合物。离心去除其中不溶的杂质,低温真空干燥剩余上清液,使用流动相复溶干燥后的剩余物达到浓缩效果。b.使用标准品进行预实验,得到靶物质的HPLC和MS的测定条件以及出峰时间。c.根据已有文献和预实验获得的靶物质的MTA以及相关化合物的浓度,使用标准品绘制相关的浓度线性回归标准曲线。d.测定各样品中的靶物质含量。(4)蛋白质免疫印迹(Western blot)实验检测各组MTA相关代谢酶的蛋白水平。研究结果:(1)代谢组学结果显示:缺氧状态下,LXA4作用的T2组细胞,S-(5’-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-Adenosyl-L-homocysteine,SAH)、MTA、左旋色氨酸、吲哚、氨乙基亚磺酸、乙酰神经氨酸、右旋甘露糖、右旋苏糖醇、氧代己二酸、维生素B1、烟酸、脯氨酸高于对照T1组;而甘氨酸、肌酸、CMP、乙酰肉碱等则低于T1组。(2)常氧条件下,对照C1组细胞与加入LXA4处理的C2组细胞MTA及其相关化合物含量,以及MTA代谢酶的蛋白水平均没有显著性差异(p>0.05)。(3)对照C1组与缺氧培养的T1组相比:HPLC-MS结果显示,T1组的SAH含量显著低于C1组(p<0.01),而S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)和MTA的含量明显高于C1组(p<0.01);Western blotting结果显示,T1组的甲硫腺苷脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)的蛋白水平显著低于C1组(p<0.01);T1组的亚精胺合酶(Spermidine synthase,SRM)的蛋白水平显著高于C1组(p<0.01)。(4)缺氧条件下,对照T1组与加入LXA4的T2组细胞相比:HPLC-MS结果显示,T2组细胞MTA和SAH的含量显著高于T1组(p<0.01),而SAM的含量低于T1组(p<0.01);Western blotting结果显示,T2组的甲硫腺苷磷酸化酶(5’-methylthioadenosine phosphorylase,MTAP)、SRM以及的SAMDC酶原的蛋白含量显著低于T1组(p<0.01),而SAMDC的蛋白水平显著高于T1组(p<0.01)。研究结论:(1)常氧条件下LXA4对Hep G2细胞中MTA以及相关化合物的代谢没有显著影响。(2)缺氧刺激下,Hep G2细胞中SAH含量和SAMDC的蛋白水平均降低,SRM的蛋白水平、SAM和MTA含量升高。(3)LXA4在缺氧条件下有可能通过促进SAMDC的合成以及激活SAMDC的酶原转化为SAMDC,同时或者降低MTAP的含量,从而提高细胞中的MTA的含量。SRM含量的降低,有可能是由于MTA增高后负反馈抑制的结果。这可能是LXA4抑制肝癌的机制之一。