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本论文主要对一株耐冷菌,南极微球菌AS1.2372(Micrococcus antarcticus AS1.2372)所产的两种低温酶进行了研究。
首先,采用单因素摇瓶发酵试验对南极微球菌(Micrococcus antarcticus AS1.2372)产低温淀粉酶的条件进行了优化,优化后的培养基组成(g/L)及发酵条件为:Na2HPO42.0、KH2PO41.0、MgSO4.7H2O0.1、NaCl5.0、(NH4)2SO42.5、麦芽糖5.0,微量元素溶液5.0 mL,,pH8.0;500 mL三角瓶装液100 mL,12℃,160r/min振荡培养64h。在此条件下,发酵液酶活由优化前的0.24 U/mL提高到2.6U/mL,是优化前的10.8倍。发酵液经Millipore超滤膜包浓缩、Hitrap-Q HP离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析纯化该低温淀粉酶。酶学性质研究结果表明,其最适作用温度为30℃,在10~15℃下仍具有较高活性,但对热极其敏感,属于典型的低温酶:最适作用pH为6.0,在pH6.0~10.0范围内较稳定(>70%);Ca2+、Mn2+、Co2+、Mg2+对该酶有较为明显的激活作用,而Zn2+、Ba2+、Ag+、Cu2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Hh2+、螯合剂EDTA、Citrate则对该酶有不同程度的抑制作用;并且在Tween系列及TrintonX-100等非离子型表面活性剂中表现出较好的稳定性:酶的动力学参数Km为0.90 mg/mL。
其次,以质粒pUC18和高效转化态细胞E.coli OmniMAX2-T1构建了该菌株的基因组文库,试图通过碘.淀粉法筛选出上述低温淀粉酶的基因,得到的十个左右能够在淀粉选择性培养基上生长的阳性克隆经测序分析并没有得到与已知淀粉酶序列有明显相似性的基因,但是意外得到一个编码β-葡萄糖苷酶的完整开放阅读框,考虑到其比对结果与已知的β-葡萄糖苷酶基因相似性较低并且是低温菌来源的,便对其进行了克隆表达和酶学性质研究。
最后,把筛选到的β-葡萄糖苷酶基因亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,转化到大肠杆菌BL21(DE3),PCR和双酶切验证结果表明,表达载体构建成功。重组菌株经IPTG诱导,重组蛋白经镍柱纯化和超滤浓缩脱盐后进行酶谱分析,结果显示该重组蛋白可以酶解MUG,具有水解β糖苷键连接的化合物的能力。对重组酶的酶学性质研究结果表明,其最适作用温度为25℃,在0℃下仍具有较高活性,但对热极其敏感,属于典型的低温酶;最适作用pH为6.5,在pH6.0~8.0范围内较稳定(>80%);Mg2+、Mn2+、Ca2+、Na+对该酶有较为明显的激活作用,而5 mmol/L的Fe2+、Cu2+、Hg2+、Ag+、EDTA、SDS等则完全抑制了该酶活性;在所测定的底物中,纤维二糖为该酶的最适底物,其次是对硝基苯-β-D-葡萄糖苷,在最适反应条件下,以对硝基苯-β-D-葡萄糖苷为底物时,测得此重组酶的Km为7mmol.L-1,Kcat为7.85×103S-1,葡萄糖和葡萄糖酸内酯这两个竞争性抑制剂对其抑制常数分别146.7 mmol.L-1、0.3 mmol.L-1。