研究背景和目的脊椎动物的肠道中栖息着数以万计的微生物,它们组成一个复杂的群落,称为肠道菌群。肠道菌群与宿主在长期的协同进化下相互适应,实现免疫动态平衡。一方面,微生物群可以促进宿主免疫系统的成熟,另一方面,宿主通过免疫反应感知和响应微生物群,而这种免疫反应促进有益微生物的定植,同时抵抗病原菌的入侵,从而维持宿主与肠道菌群之间的互利共生。研究显示肠道菌群的组成显著促进免疫平衡,而宿主对特定细菌种类的感知,触发了维持宿主和肠道菌群之间平衡所需要的反应。分节丝状杆菌(segmented filamentous bacteria,SFB)作为肠道菌群的重要成员,因其能促进小鼠肠道固有层Th17细胞的积累而引起广大科研人员的关注。SFB是一种革兰氏阳性芽孢杆菌,其形态呈叶状和丝状,广泛地定植于多种脊椎及非脊椎动物的回肠末端。这类细菌紧密粘附于小肠上皮细胞,影响着宿主的先天性与适应性免疫应答。Th17细胞是CD4+T细胞的一类亚群,其特征是产生IL-17相关细胞因子,如IL-17A、IL-17F和IL-22等。这些细胞因子作用于多种造血细胞及非造血细胞来调节宿主免疫,包括中性粒细胞的招募及抗菌肽的形成。因此Th17细胞在维持肠上皮细胞稳态和帮助宿主抵抗细胞外病原菌方面发挥着重要作用。目前,大量的研究证明SFB能诱导小鼠肠道Th17细胞的分化,但SFB诱导Th17细胞分化的分子机制尚不清楚。大多数已报道的微生物免疫效应是通过模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)介导的,如细菌的鞭毛蛋白可以被Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)识别。众所周知,细菌鞭毛基因是影响细菌定植和宿主免疫调控反应的重要功能基因。当鞭毛蛋白附着到肠上皮基底部后可以启动天然免疫应答及鞭毛蛋白介导的促炎应答反应。同时,小鼠SFB的全基因组测序结果显示,虽然SFB丢失了许多维持其生长和生存所必需的酶,但它们编码超过40多个鞭毛和趋化相关蛋白,具有一套完整的生物合成鞭毛蛋白基因。另外,比较基因组分析显示SFB基因组与梭菌属的基因组相似,虽然有几种梭菌基因组也能编码鞭毛蛋白,但只有SFB的鞭毛蛋白具有TLR5结合位点。综上所述,虽然SFB在促进肠道Th17细胞分化方面发挥着重要作用,但SFB如何与宿主细胞相互作用的还知之甚少。通过电镜观察可知SFB紧密吸附在小肠粘膜上皮细胞,但SFB吸附到宿主细胞的分子机制尚不清楚。虽然在电镜下没有观察到SFB的鞭毛结构,但全基因组分析显示SFB具有一套完整的生物合成鞭毛蛋白基因。鉴于鞭毛蛋白相关基因在SFB基因组中所占的比例(3%)以及细菌鞭毛蛋白在其他细菌中的重要功能,我们推测SFB鞭毛蛋白可能是宿主免疫细胞应答的抗原。前期我们通过多种实验方法验证SFB表达鞭毛蛋白,同时本研究通过利用重组的SFB鞭毛蛋白在小鼠体内外探究SFB鞭毛蛋白与宿主细胞的相互作用。第一部分:SFB鞭毛蛋白在体外对Th17细胞的诱导作用目的:初步探讨SFB鞭毛蛋白在体外是否能刺激免疫细胞,参与一定的免疫调控反应。方法:1)用机械研磨和密度梯度离心等方法分离小鼠肠道固有层淋巴细胞,并用流式分选及磁珠分选等方法分离CD4+T细胞及CD11c+细胞。2)将SFB鞭毛蛋白的主要序列克隆到表达载体PET-28a上,体外纯化SFB鞭毛蛋白。3)SFB鞭毛蛋白与小鼠肠道固有层淋巴细胞共孵育,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、酶联免疫斑点检测(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT)以及实时荧光定量PCR技术(Quantitative real-time quantitative,q RT-PCR)检测肠道固有层淋巴细胞的免疫特征及Th17相关细胞因子的表达水平。结果:1)研究显示不管是大鼠来源还是小鼠来源的SFB鞭毛蛋白(SFB-r Fli C3、SFB-m Fli C3、SFB-m5i-Fli C3)都能有效地诱导CD4+T细胞分泌IL-17A,并且IL-17A的表达水平随孵育时间逐渐升高,在72 h效果最佳。2)SFB鞭毛蛋白在体外增加了Th17细胞的反应性,并显著地促进了Th17相关细胞因子的表达。第二部分:SFB鞭毛蛋白促进小鼠肠道Th17细胞的产生目的:进一步探究SFB鞭毛蛋白在体内对小鼠小肠Th17细胞的影响。方法:1)将大鼠及小鼠来源的鞭毛蛋白(SFB-r Fli C3、SFB-m Fli C3、SFB-m5i-Fli C3)腹腔注射到小鼠体内,不同时间点取小鼠回肠末端组织及血清样品分析。2)裂解小鼠回肠组织,收集组织蛋白,ELISA检测小鼠组织及血清相关细胞因子的浓度。3)提取小鼠回肠组织总RNA,q RT-PCR检测小鼠回肠相关细胞因子的表达水平。结果:1)SFB鞭毛蛋白注射到小鼠体内2 h后,Th17细胞显著增加,主要表现为肠道和血清中的Th17相关细胞因子的表达及转录水平如IL-6和IL-17A显著升高。2)然而SFB鞭毛蛋白注射到小鼠体内24 h后,小鼠肠道及血清细胞因子的表达及转录水平都恢复正常水平。第三部分:SFB鞭毛蛋白对小鼠肠道基因表达谱的影响目的:比较不同鞭毛蛋白处理组与对照组小鼠回肠的基因表达谱,进一步确定SFB鞭毛蛋白对宿主基因表达的影响。方法:1)将纯化的大鼠及小鼠来源的SFB鞭毛蛋白(SFB-r Fli C3、SFB-m Fli C3、SFB-m5i-Fli C3)腹腔注射到小鼠体内,2 h后,收集小鼠回肠末端0.5 cm组织,提取总RNA,进行RNA测序(RNA-Seq)。2)提取小鼠脾脏总RNA,q RT-PCR检测小鼠脾脏Th17相关细胞因子的表达水平。结果:1)四种不同鞭毛蛋白给药后,小鼠多个基因的表达都发生显著变化,且这四个显著差异基因组存在部分重叠,共有594个基因。2)GO和KEGG富集分析发现小鼠来源的SFB鞭毛蛋白(SFB-m Fli C3)显著地诱导了免疫系统信号通路。如趋化因子信号通路、Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路都发生显著改变。3)基因表达谱显示IL-17介导的信号通路相关细胞因子,如促Th17细胞因子,趋化因子,抗菌肽等都显著升高。4)SFB鞭毛蛋白处理后,小鼠脾脏Th17相关细胞因子的表达水平没有显著差异。第四部分:SFB鞭毛蛋白与宿主肠上皮细胞具有相互作用目的:初步探讨SFB鞭毛蛋白促进肠道Th17细胞分化的可能机制,为研究SFB调控肠道免疫的分子及细胞机制奠定基础。方法:1)收集小鼠回肠末端组织,并提取总RNA,RNA-Seq分析小鼠肠上皮相关基因的表达谱。2)纯化的SFB鞭毛蛋白注射到小鼠体内,收集小鼠回肠末端组织,提取总RNA,q RT-PCR检测小鼠肠上皮相关细胞因子的表达水平。3)SFB鞭毛蛋白与小鼠肠上皮细胞系(MODE-K)共孵育24 h,收集细胞提取总RNA,q RT-PCR检测MODE-K细胞特定基因的转录水平。4)TLR5阻断抗体中和CD4+T细胞及CD11c+细胞表面的TLR5受体,SFB鞭毛蛋白刺激72 h,酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测Th17相关细胞因子的表达水平。结果:1)小鼠肠上皮的基因表达谱显示SFB鞭毛蛋白处理后的小肠,其上皮细胞一些基因的表达高度上调,如Duox2、Duoxa2、Nos2、SAAs等,并且q RT-PCR进一步验证了这些基因的表达。2)在MODE-K与鞭毛蛋白共孵育的实验中,证明SFB鞭毛蛋白能诱导肠上皮细胞表达血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAAs),进而促进Th17细胞的分化。3)当TLR5中和抗体阻断细胞表面的TLR5受体后,SFB鞭毛蛋白对T细胞的活化作用没有明显减弱,证明SFB鞭毛蛋白促进T细胞活化可能与TLR5激活无关或至少不只与TLR5有关。结论:本研究发现单独的SFB鞭毛蛋白与SFB具有相似的免疫功能,SFB鞭毛蛋白可能是SFB在调节肠道免疫过程中一个关键的蛋白组分。主要表现在SFB鞭毛蛋白可以单独诱导小肠Th17细胞的产生,且与宿主上皮细胞具有相互作用。我们的结果在一定程度上为揭示SFB诱导肠道Th17细胞分化过程中的分子机制提供了新的思路。