血清蛋白标志物的开发对结直肠癌(CRC)的预防、诊断和预后等方面具有重要意义。本研究试图构建一种CRC血清蛋白标志物开发的新型路线,以改进传统方法无法发现肿瘤发生发展早期的提示性标志物和候选标志物验证效率低下的问题。我们以对CRC发生发展过程中结肠组织间隙液(TIF)蛋白丰度的动态定量检测来实现生物标志物的寻找,并假设随肿瘤发展呈现持续上调变化的TIF蛋白为筛选CRC血清标志物的良好选择,最后通过在小鼠和人类CRC血清样本中的一系列实验来检验该假设并评估候选标志物的应用前景。我们成功构建了AOM-DSS小鼠结肠癌模型并建立了使用窄pH范围(pH 3-6)IPG胶条有效分离TIF肽段的方法。通过对该模型肿瘤不同发展时期(Cycle Ⅰ、Cycle Ⅱ、Cycle Ⅲ)的结肠中下段TIF蛋白质组的动态定量研究,我们成功定量了584个TIF蛋白,其中约有66%是理论预测的分泌蛋白或已知的血清蛋白。我们从TIF蛋白中筛选得到144个显著差异蛋白质,并根据其丰度变化趋势将其分为持续上调(n=45)、持续下调(n=17)和非持续变化(n=82)三类。随后,我们在16只小鼠的TIF样本内以多重反应监测(MRM)技术对24个持续性丰度变化蛋白进行个体化定量检测,确证了其中18个蛋白质(持续上调蛋白12个,持续下调蛋白6个)的iTRAQ定量结果。为了检验CRC相关TIF蛋白是否具有成为CRC血清标志物的潜质,我们在该小鼠模型的血清样本中开展了针对12个持续上调蛋白的个体化MRM定量检测,结果表明：CycleIII组中LRG1、TUBB5和IGJ的丰度较Control组显著上调。随后,我们同样以MRM技术检测了16例CRC患者及16例健康人血清样本中这三个蛋白质的丰度,以初步评估其作为候选标志物在人类血清中应用的兼容性。与健康对照组相比,LRG1和TUBB5在CRC组呈现出了显著的丰度上调,而IGJ在两组中无显著差异变化。受试者工作特征曲线分析表明,LRG1、TUBB5的曲线下面积分别为0.74和0.70,且这两个指标的联合使用有助于提高检测的特异性。为了评估候选标志物的临床应用潜能,我们在扩大的临床血清样本中对LRG1的绝对浓度进行双抗夹心ELISA检测,发现其在CRC组较健康对照组显著上调,且当阈值为34.56μg/mL时,血清LRG1区分健康对照和CRC的灵敏度为59.3%、特异性为79.6%,表明LRG1具有一定的CRC血清标志物应用前景。随后,我们以组织芯片免疫组化实验对比了结肠癌及其癌旁组织内LRG1的表达丰度,结果表明LRG1在结肠癌上皮细胞中显著上调,且其在两种不同的肿瘤原发灶情况(T3 vs. T1)、肿瘤远端转移与否(M1 vs. M0)及三种不同的肿瘤分期(Stage Ⅳ vs. Stage Ⅰ, Stage Ⅳ vs. Stage Ⅱ)内部具有显著的差异表达。以上结果表明,将小鼠模型结肠TIF样本的动态定量蛋白质组学研究和在临床血清样本中对候选标志物的靶标性定量检验结合起来,是一种新型的CRC血清蛋白标志物开发的有效技术路线。我们应用这一思路成功地发现了LRG1这一蛋白质,并在CRC患者血清及结肠癌肿瘤组织中验证了其在疾病状态下的丰度变化,为CRC的诊断及预后判断提供了一个新的候选血清蛋白标志物。