论文部分内容阅读
猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）严重威胁养猪业的健康发展。自2016年首次报道PCV3病毒感染以来,其已在世界范围内流行,对养猪业带来巨大的经济损失。本研究基于PCV病毒的生物学特性、基因结构特征等制备了PCV3 Cap蛋白特异性单克隆抗体及获得了PCV3感染性克隆,同时建立了PCV2与PCV3的双重荧光定量PCR检测方法。在此基础上,基于获得的抗体制备了PCV3荧光免疫层析检测试纸条,同时对广东地区收集的PCV3感染病料进行初步检测,以综合评估PCV3荧光免疫层析检测试纸条的应用价值。本研究根据PCV具有单一衣壳蛋白的生物学特性,采用去除核定位信号序列的策略,人工合成三种基因型的PCV-Cap并克隆至原核表达载体p ET-32a（+）中,成功构建p ET-PCV-Cap三个重组载体,进而通过原核表达的方法,分别获得了PCV3、PCV2、PCV1 Cap蛋白。以重组PCV3 Cap蛋白为抗原免疫小鼠,应用杂交瘤细胞融合与有限稀释克隆技术制备了两株单克隆抗体（B6、D17）。通过抗体特异性试验证实B6及D17单克隆抗体仅与PCV3 Cap蛋白发生免疫反应,而与PCV2及PCV1 Cap蛋白不发生交叉反应。抗体的亚型分析结果表明B6抗体亚型为Ig G1,而D17抗体亚型则为Ig G2a。通过间接ELISA检测,结果证实B6抗体效价为2×10~5,D17抗体效价为6×10~5。此外,通过免疫印迹试验对所获得的抗体与PCV3 Cap蛋白及PCV3进行了初步检测,结果表明B6及D17单克隆抗体可以与PCV3 Cap蛋白及PCV3病毒发生免疫印迹反应。此外,本研究根据PCV基因组DNA为环状结构的特征,通过对现有的线性PCV3基因序列进行重排,从而使重排后的线性DNA序列的两端具有单一限制性酶切位点,再通过常规的分子生物学操作方法,最终在体外获得了PCV3环状DNA。鉴于PCV具有侵染淋巴细胞、巨噬细胞的特性,因此将获得的PCV3环状DNA转染到猪肺泡巨噬细胞系对PCV3病毒进行拯救。同时根据PCV3线性DNA的首尾端序列设计反向扩增引物,在PCR扩增过程中,该引物能与线性DNA模板结合,却不能进行扩增,而对于环状DNA,该引物则可以进行PCR扩增。基于此,通过使用该引物以及PCV3Cap基因特异性检测引物对连续培养3代的PCV3病毒进行PCR鉴定,结果表明,在每一代病毒液中均可以检出PCV3环状DNA及其Cap基因。为了进一步对所获得的病毒株进行验证,本研究对F3代PCV3病毒的滴度进行了检测,结果表明F3代PCV3的TCID50为10-4.8/m L。为了对构建病毒的致病性进行初步评估,本研究使用昆明小鼠作为感染模型,通过解剖观察,与阴性对照组相比,感染组小鼠的内脏未出现明显的病理变化。进一步通过PCR及免疫学检测方法对小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行检测。结果表明在感染组小鼠的心肌及肺脏内检测到PCV3 Cap基因。免疫印迹试验及免疫组化试验结果证实PCV3可以感染小鼠的心肌及肺泡组织。这与目前PCV3可以感染小鼠的研究报道相吻合。为了收集更多的PCV3阳性病料,本研究通过构建PCV2与PCV3的全基因组DNA克隆质粒并以此作为检测模板分别建立了PCV2、PCV3荧光定量PCR检测方法。研究结果表明PCV2荧光定量PCR检测的最低拷贝数为9.35×10~1copies/μL,而PCV3检测的最低拷贝数为1.05×10~1copies/μL。为了同时对PCV2与PCV3进行鉴定并降低检测成本,本研究还建立了一种可以同时检测PCV2与PCV3的双重荧光定量PCR检测方法,通过重复性分析试验,证明所建立的双重荧光定量PCR方法可以用于PCV2及PCV3的鉴别诊断。基于以上研究方法,本研究对收集的病料进行检测,结果表明在160份病料中PCV2、PCV3阴性样品为45份。在115份PCV的病料组织中,其中PCV2阳性的为80份,阳性率为69.5%,PCV3阳性的为35份,阳性率为30.4%。PCV2、PCV3均为阳性的样品为28份,共感染率为24.3%。本研究在获得PCV3 Cap蛋白特异性单抗抗体、PCV3病毒株的基础上,应用双抗体夹心法,通过抗体配对试验获得了一对可以用于特异性检测PCV3的抗体对,再与荧光微球偶联,并于NC膜的检测线及质控线分别包被PCV3 Cap蛋白单克隆抗体及羊抗鼠Ig G抗体,之后对试纸条进行组装,初步制备了PCV3荧光免疫层析检测试纸条,并对荧光微球活化剂量以及抗体的使用剂量进行优化。结果表明活化荧光微球的EDC（10 mg/m L）工作液的最佳体积为35μL,PCV3 Cap蛋白抗体的最佳使用质量为80μg。通过对试纸条的敏感性进行检测,结果表明,所建立的PCV3荧光检测试纸条能够检测到PCV3 Cap蛋白的最低浓度为10 ng/μL。利用试纸条对CSFV、PPV、PRRSV、PCV1、PCV2、PCV3病毒进行检测,结果表明所建立的PCV3荧光检测试纸条仅能检测PCV3病毒。对试纸条的稳定性进行检测,表明在4℃保存60天的试纸条仍具有良好的检测效果。通过对临床样品的初步检测结果得知,荧光免疫层析试纸条检测方法的灵敏性低于PCR检测法,但综合考虑检测成本,检测时间等因素,PCV3免疫层析试纸条检测方法仍具有重要的应用价值。本研究为后续开展有关PCV3毒力、相关致病因子及病毒与宿主相互作用的研究提供了前期基础,同时为临床检测PCV3病毒提供一种辅助手段。