目的本研究通过分离提取氧化应激状态下视网膜色素上皮细胞(Retinal Pigment Epithelium cells,RPE)分泌的外泌体(exosome),探索分析此外泌体对于正常RPE细胞增殖及细胞因子VEGF-A、Akt的影响,为RPE细胞外泌体与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病机制的相关性提供实验依据。方法1、培养人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19),收集上清液,通过3种方法分离提取外泌体:超速差速离心法、Exosome提取试剂盒(SBI)、size exclusion qEV法,透射电镜下观察外泌体形态,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63。细胞培养基中分别加入浓度为0、1、2.5、5μmol/L鱼藤酮模拟氧化应激损伤,观察分析不同浓度鱼藤酮对细胞增殖情况的影响。2、选定2.5μmol/l鱼藤酮诱导ARPE-19细胞损伤,制备氧化应激损伤下ARPE-19-exosome。外泌体与正常ARPE-19细胞共培养,采用MTT法检测细胞增殖活力。Western blot法、免疫荧光检测共培养后ARPE-19细胞中细胞因子Akt、VEGF-A在蛋白水平表达的变化。RT-PCR检测共培养后ARPE-19细胞的VEGF-A、Akt mRNA的表达。统计方法:实验数据使用SPSS18.0软件进行统计分析。所有计量资料数据均采用均数±标准差表示,MTT实验各组的总体差异采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验,其余两组组间比较采用配对样本t检验,p<0.05认为差异具有显著性。结果1、正常ARPE-19细胞分泌的外泌体,形态呈圆形或近似圆形的小囊泡,直径在50-150nm之间。蛋白质免疫印迹法结果显示,外泌体表达表面特异性标记蛋白CD63。MTT比色法检测细胞增殖能力结果显示鱼藤酮对ARPE-19细胞增殖有抑制作用,随鱼藤酮浓度增加,抑制作用增大,差异具有显著性(p<0.05)。2、选取2.5μmol/L鱼藤酮成功诱导ARPE-19细胞氧化应激损伤,ARPE-19-exosome与正常ARPE-19细胞共培养后,MTT法检测与对照组相比,发现其对细胞增殖有抑制作用,差异有显著性(p=0.002)。荧光显微镜下观察,胞浆内的绿荧光,与对照组相比,VEGF-A表达较强,Akt表达较弱。Western blot实验结果显示氧化应激作用下ARPE-19-exosome处理组细胞因子Akt表达低于对照组(p=0.003),细胞因子VEGF-A表达高于对照组(p=0.001),差异有显著性(p<0.05)。RT-PCR结果显示,VEGF-A mRNA表达实验组(2.37±0.43)高于对照组(0.54±0.07),Akt mRNA表达实验组(0.64±0.11)低于对照组(3.05±0.58),差异具有显著性(p<0.05)。结论ARPE-19细胞分泌具有生物学功能的外泌体,氧化应激作用下ARPE-19细胞分泌外泌体可抑制正常AREP-19细胞的增殖,上调VEGF-A的表达,下调Akt的表达。