在人类基因组编码蛋白质的三万多个基因中,约30%编码的是膜蛋白质。膜蛋白质在生命过程中起着关键作用,参与了很多基础生命活动。它们作为载体帮助营养物质分子完成跨膜转运；作为受体帮助传导各种细胞信号；作为通道精细调控小分子与离子在细胞内外的浓度等等。因此,对膜蛋白质的结构与功能的研究直接关系到生命科学发展中的一些基础科学问题。与膜蛋白质的重要性及其在所有蛋白质中所占比重形成强烈反差的是,我们对于膜蛋白质的结构和功能的了解十分有限,这极大地限制了一些生命科学或者医学相关领域的发展。研究已经发现膜蛋白质与许多人类重要的疾病,如神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等疾病的病理机制有直接关系。本论文分别以G蛋白偶联受体(G2accumulation, G2A)以及质子耦合锰离子转运蛋白(H+-coupled manganese transporter, MntH)这两种膜蛋白为研究对象,应用生化技术和手段研究其作用机理、结构和功能之间的关系,为相关疾病靶向诊疗以及药物开发提供研究基础和科学依据。G2A受体属于一类质子敏感的G蛋白偶联受体家族,可调控细胞周期、增殖、癌变及免疫反应信号转导等。其中G2A调控的信号转导受胞外pH的调控,但机制尚不清楚。为了探究这一问题,本论文首次应用Sortase A转肽酶调控的特异性荧光标记法建立了G2A N端标记方法,并利用此方法实现了对pH依赖的G2A在细胞内的时空动态分布可视化。首先应用免疫荧光印迹、免疫荧光染色和流式细胞术(FACS),定性、定量检测了G2A受体蛋白在人胚胎肾细胞(Human Embryo Kidney293T, HEK293T)内的转染和表达；HEK293T细胞表面表达的G2A融合短肽标签在SrtA调控下被小分子荧光染料标记,标记后的细胞在酸性或中性条件下进行共聚焦显微镜实时观测。研究结果发现在酸性条件下,G2A受体从细胞膜表面内吞至胞内的过程受到抑制,而在中性条件下这种抑制得到缓解；而G2A的配体溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine, LPC)的存在则对G2A受体pH依赖的内吞现象有拮抗作用。当环境的pH由中性变为酸性时,内吞在胞内的G2A受体会重新分布至细胞膜上。作为对照,pH非敏感性突变体G2A-H174F的受体内吞在不同pH条件下无明显差别,LPC非敏感性突变体G2A-R203A也未表现出LPC对受体原发性内吞现象的明显抑制。这些研究结果表明G2A受体在细胞膜表面的数量受胞外pH的调控,胞外低pH抑制G2A的内吞速率,从而导致在酸性条件下G2A在细胞膜表面的积累,由此推测在低pH条件下G2A调控的信号转导增强与其在细胞的内吞有关。自然抗性相关巨噬细胞蛋白(Natural Resistance Associated Macrophage Protein, Nramp)家族是哺乳动物细胞中的一类二价金属离子转运蛋白家族,但是对其转运机理和结构了解甚少。本论文选取Nramp的细菌(E.coli)同源体MntH,通过生物化学技术结合现代波谱学技术研究其活性、结构和转运锰离子的机理。利用MntH同向转运金属锰离子和质子的特性,首先发展了一种基于pH敏感性荧光探针的MntH转运活性的检测方法。利用pH敏感性荧光探针5-(and-6)-carboxyfluorescein (5(6)-FAM)检测转运前后细胞外荧光强度的变化来测定MntH转运Mn2+活性,方法简单、高效,优于传统的同位素方法。运用这种方法可以很容易确定野生型MntH和各种保守残基突变体之间的活性差异。为了探索MntH结构与转运功能之间的关系,本论文单独研究了对MntH转运活性有重要影响,含有重要保守酸性残基的跨膜多肽MntH-TM3。利用圆二色谱(CD)和二维核磁谱(2D-NMR)重点考察了MntH-TM3在三氟乙醇(TFE)、十二烷基硫酸钠(SDS)及脂质体等类膜环境中的空间构象。初步研究发现跨膜多肽MntH-TM3在高浓度TFE、SDS或脂质体中主要采取α-螺旋结构,其结构受锰离子或环境中质子浓度的影响。研究发现影响MntH活性的重要氨基酸残基位点与锰离子作用下的多肽结构变化密切相关。这些研究结果对进一步研究和推测MntH结构与功能的关系,探索这类新型金属转运蛋白质的结构和转运机理提供了重要的研究基础。