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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)为一种革兰氏阳性细菌,它在芽胞形成期能够产生一种或者多种由基因cry/cyt编码的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)。近年来国内很多学者从不同省份不同地域的土壤中相继分离到高毒力的Bt的新菌株。但是针对高海拔地区不同生态环境的Bt资源报道鲜少。四川西部地面海拔高度为2500-4500米的高海拔地区,包括有原始森林、草原、湿地、冰川等不同的生态环境,气候区域表现差异显著。本实验立足于四川西部高海拔地区,对其不同生态环境中Bt资源分布以及筛选新型杀虫基因进行研究,结果如下:1、从四川西部高海拔地区不同的生态区采集的912份土样中,共分离出351株苏云金芽胞杆菌,利用光学显微镜从中初步鉴定出161株产晶体Bt菌,平均分离率为38.49%(Bt菌占所有芽胞杆菌的比率)和产晶体的Bt分离率为17.65%。这161株Bt菌所产生的伴胞晶体形状有大(小)菱形、方形、米粒形、大(小)球形、不规则形等。随着海拔高度的增加,Bt分离率开始下降;原始森林的Bt分离率高于雪山与草地的分离率。这充分显示了川西高海拔地区不同生态区Bt资源的多样性。2、采用PCR-RFLP鉴定方法对161株产晶体菌株进行了cry 基因的鉴定分析,发现cry1、cry1、cry2、cry4、cry5、cry6、cry9、cry12、cry14、cry15、cry18、cry28、cry30、cry54、cry57等15种基因型。cry1类基因型最多,占50%;其次是cry16类46.36%,cry9类 30.9%,cry1I类 29.09%,cry15类 27.27%,cry30 类 21.81%,cry4类17.27%,而其他种类的基因型偏少。3、对产晶体的Bt菌株进行蛋白电泳分析,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)结果显示这些基因主要表达30-130KDa大小的蛋白。161株产晶体菌株分别对玉米螟、甜菜夜蛾、棉铃虫、小菜蛾、小地老虎和秀丽隐杆线虫进行生物活性测定。其中18.6%的菌株对小菜蛾具有杀虫活性:19.87%的菌株对棉铃虫具有杀虫活性;31.7%的菌株对甜菜夜蛾具有杀虫活性;13%的菌株对小地老虎具有杀虫活性;17.39%的菌株对玉米螟具有杀虫活性;17.4%的菌株对秀丽隐杆线虫具有杀虫活性。分析发现,产菱形与方形晶体的Bt菌株对鳞翅目害虫的杀虫效果最佳,其次是产米粒形晶体的Bt菌株,部分球形晶体菌株对棉铃虫和甜菜夜蛾有杀虫效果,但半致死浓度(LC50)较高。4、从161株菌株中选择了 1株对秀丽隐杆线虫作用较好的产菱形晶体菌株和2株对鳞翅目具有杀虫活性的产球形晶体菌株进行下一步研究。通过全基因组测序,得到了 4个与已知基因同源性较低的片段,通过简并引物方法,聚合酶链反应(PCR)克隆得到了这 4 个新基因,分别为cry32Y-like、cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like,与已知基因cry32Hb1、cry32Sa1、cry9Ha4以及cry72Aa1的同源性分别为55%、45%、48%、95%。cry32Y-like、cry32X-like 与cry9H-like均为第二级基因,cry72A-like为第四级基因。cry32Y-like全长为4107bp,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-32Y,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,产生球形晶体。cry32X-like、cry9H-like、cry72A-like 全长分别为 1896bp、2096bp 与 2127bp,将其插入原核表达载体pET-28a获得重组质粒pET-32X、pET-9H与pET-72A,重组质粒再转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温诱导成功表达蛋白。表达蛋白分别对玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫、番茄根结线虫进行生物活性测定。结果显示:Cry32Y-like对秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫活性较好,72h后校正死亡率分别为72%与64%,LC50分别为803μg/mL与920μg/mL。Cry32X-like表达产物对甜菜夜蛾、秀丽隐杆线虫与番茄根结线虫的杀虫效果较好,校正死亡率分别为65%、76%与 70%,LC50 分别为 710μg//mL、421μg/mL 与 603μg/mL。Cry9H-like 表达产物对棉铃虫有一定的杀虫活性,7d后校正死亡率为45%,抑制生长率为55%。Cry72A-like表达产物对甜菜夜蛾具有极高的杀虫活性,7d后校正死亡率为95%,LC50 为 961μg/mL。5、cry71Aa1与cry72Aa1为第一级新基因,将其插入穿梭表达载体pSTK获得重组质粒pSTK-71A与pSTK-72A,去甲基化后转入无晶体突变株HD73-,均产生球形晶体。表达蛋白活性测定结果显示,Cry71Aa1与Cry72Aa1对番茄根结线虫表现出一定的作用效果,72h后校正死亡率分别为76%与53%,LC50分别为542μg/mL与872μg/mL。6、已知基因表达蛋白对线虫的杀虫活性验证结果发现,Cry1Hc1与Cry1Aj1对秀丽隐杆线虫的杀虫效果较好,72h校正死亡率达到84%、82%。以上这些基因分别对鳞翅目昆虫与线虫表现出了杀虫活性,这不仅丰富了杀虫新基因的种类,也为新基因杀虫谱提供一定的实验依据。