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戊型肝炎(HepatitisE)是由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的急性病毒性肝炎,主要通过粪口途径传播,常因饮用水源被污染导致暴发流行,散发病例呈全球性分布。自从学者Meng第一次报道从猪体内分离到HEV以后,许多学者进行了动物感染HEV的调查和实验感染研究,越来越多的证据提示HEV是一种人兽共患病病毒,许多动物对HEV表现为易感,对于缺乏稳定有效的HEV细胞培养体系的现状,这一发现对于HEV的深入研究提供重大突破。但是,具体的动物感染实验结果表明,仅有非人灵长类动物感染HEV效果比较好,其它动物感染效果不佳。由于非人灵长类动物的价格高、难饲养和数量有限等原因又限制了其应用。选择一个既感染效果好又经济适用的HEV小动物感染对象用于HEV的实验研究很有必要,为此,本实验选用ZCLA长爪沙鼠作为HEV感染对象,开展以下研究并获取如下成果:
第一部分粪便的采集和鉴定
收集临床确诊为戊型肝炎的患者粪便6份,采用RT-nPCR法获得扩增片段并连接至载体PMD-19T后进行克隆测序鉴定,含HEV阳性的标本保存待用。结果本实验从6份标本中获取1份HEV阳性粪便,此粪便保存待用。
第二部分荧光定量PCR检测HEV方法的建立
根据GenBank中提交的HEV全序列分析选取HEVORF2保守区域作为目的扩增序列,设计引物和Taqman探针,建立荧光定量PCR检测HEV的方法,并检测其灵敏度和稳定性。实验结果表明,本实验建立的荧光定量PCR检测HEV的方法,最高检测灵敏度为5copies,在5×10copies~5copoies标准品质粒范围内,标准曲线内的8个点具有良好的线性关系,相关系数R2值达0.998。组内重复性检测显示其变异系数(CV)范围在0.02%~1.40%之间,组间重复性检测显示其变异系数(CV)范围在0.87%~2.24%之间,具有良好的稳定性和重复性。
第三部分戊型肝炎病毒感染ZCLA长爪沙鼠的实验
用做毒株的粪便经PBS混匀制成10%的粪悬液后分别经直径0.45μm和0.22μm过滤膜除菌,腹腔接种ZCLA长爪沙鼠100μl/只,对照组接种PBS100μl/只,ZCLA长爪沙鼠预先腹腔接种青霉素6万U/只,单只分笼养殖,按时喂养ZCLA长爪沙鼠并观察记录,每天收集粪便放于-70℃保存待检。荧光定量PCR测定毒株粪便和收集粪便的HEV滴度。实验结果表明,毒株粪便HEV滴度为4.1×103copies/g,实验组ZCLA长爪沙鼠最早于接种后第6天粪便中检测到HEV,粪便中HEV滴度逐渐升高,至第18天达到最高,为6.4×103copies/g,呈现明显波峰,随后随着时间推移HEV滴度逐渐降低,呈现下降趋势,粪便HEV阳性持续至第37天,对照组粪便HEV检测均为阴性。测序鉴定实验组ZCLA长爪沙鼠粪便含有HEV。
本实验结果表明,ZCLA长爪沙鼠感染HEV后可出现粪便排毒现象,提示ZCLA长爪沙鼠具有作为HEV感染动物模型的可能性。