抗菌肽NK-2的分子克隆、融合表达及其抑菌活性的初步研究

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抗菌肽是先天性免疫系统的重要组成成分,具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤等多种生物学效应。由于其独特的抗菌机制,不会诱发细菌的耐药性,所以是具有巨大发展潜力的新型抗菌药物。目前,抗菌肽的制备主要有生物材料提取、化学合成和基因工程表达三种方法。抗菌肽在生物组织中含量低,分离程序烦琐,提取的天然抗菌肽仅能用于氨基酸序列分析和抗菌等试验,难以满足临床应用的需要;化学合成抗菌肽的价格昂贵,在兽医临床上没有应用价值;基因工程技术是生产抗菌肽的可行方法,并取得了可喜的研究进展和显示出广阔的应用前景。弹性蛋白样多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)和内含肽(intein)介导的表达系统是最近几年发展起来的新型原核表达系统,能利用ELP温度诱导可逆相变特性和intein的自主剪切特性进行表达产物的分离纯化和裂解释放,使重组蛋白的分离、纯化过程大大简化,生产成本显著降低。NK-2是天然杀伤(Natural Killer)细胞产生的溶解素(NK-lysin)核心区的一段小肽,分子量约为3.2kDa,具有广谱的抗菌和抗原虫活性,并对哺乳动物细胞不具有溶血性。本研究分别以pTYB11和pTWIN1为模板,通过PCR扩增得Sce内含肽和Ssp内含肽编码序列。用限制酶消化法去除原核表达载体pET-EIGFP中的△I-CM内含肽和绿色荧光蛋白(GFP)编码序列,将电泳分离回收的载体片段与Sce内含肽和Ssp内含肽连接,获得的新载体分别命名为pET-ESI1和pET-ESI2。根据NK-2序列设计引物,通过重叠延伸PCR扩增出完整的NK-2编码序列,将其插入表达载体pET-ESI2中,获得重组表达载体pET-ESI2NK-2。以低温诱导法诱导重组菌表达,经SDS-PAGE检测证明能表达预期分子量的融合蛋白前体ELP-Intein-NK-2。在不同温度进行反复离心洗涤结合(NH4)2SO4沉淀,获得了较纯净的融合蛋白,并利用内含肽的自主裂解特性获得了预期大小的纯化NK-2。以DH5α大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌进行活性检测,结果显示表达纯化的NK-2具有一定的抗菌活性。本研究为重组抗菌肽的表达纯化和临床应用奠定了基础。
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