壳聚糖修饰的甜菜红素纳米脂质体的制备及其抗增殖活性研究

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甜菜红素是一种水溶性的天然色素,在植物中含量丰富,常被用作食品工业中的着色剂。甜菜红素具有多种生理活性,但在酶、氧气、高温和光照的条件下其稳定性低,易被降解;此外,甜菜红素的生物利用度不高,不易被人体吸收。因此,为了提高甜菜红素的稳定性和生物利用度,采用壳聚糖修饰的脂质体包埋甜菜红素。首先,本文采用具有正电荷效应的壳聚糖对脂质体进行表面修饰,通过静电作用与脂质体的结合,制得壳聚糖修饰的脂质体(CS-NL),以提高脂质体稳定性,同时防止纳米脂质体与食品成分的相互作用,维持药物的活性并延长和控制药物的释放。然后,对CS-NL进行结构表征和稳定性评价,最后,探究脂质体的抗氧化和抗增殖活性。本论文的主要结论如下:(1)比较了逆相蒸发法,薄膜分散法,乙醇注入法和乙醚注入法制得的脂质体的包封率,发现逆相蒸发法制备的甜菜红素纳米脂质体包封率最高,可达到21.29±1.37%。在逆相蒸发法的基础上,确定了制备甜菜红素纳米脂质体(NL)的最佳工艺条件为:磷脂浓度60 mg/m L,药脂比1:18,卵胆比6:1。优化后的甜菜红素纳米脂质体的包封率为42.67±1.67%,载药量为2.63±0.42%,平均粒径为156.40 nm,PDI为0.27,zeta电位为-19.50 mv。利用逐步滴定法,采用具有负电荷效应的壳聚糖对脂质体进行表面修饰,结果表明:结合的最佳浓度为0.6%,得到的CS-NL平均粒径为194.60 nm,PDI为0.29,zeta电位为5.80 mv。(2)采用透射电镜TEM和傅里叶红外光谱FTIR对NL和CS-NL进行了结构表征,并考察了脂质体的释药行为、稳定性和抗氧化活性。TEM分析表明,脂质体呈球形,壳聚糖包裹在脂质体外层。FTIR结果证明了壳聚糖通过静电作用力与脂质体结合。体外释放实验显示,NL和CS-NL在48 h内最终累积释放率分别为28.98±0.32%和15.79±0.20%,这说明其具有良好的缓释效果。p H稳定性实验结果表明,NL和CS-NL都对p H较敏感,随着p H的增加,NL的平均粒径变化较小,CS-NL的平均粒径先增加后减小,它们的zeta电位都有所减小。体外模拟消化实验表明NL和CS-NL在模拟口腔和胃相中相对稳定,不会被消化,而在模拟肠相中,两种脂质体均被消化。(3)抗氧化活性研究表明,NL和CS-NL的PSC和ORAC值相比甜菜红素都有所提高,且CS-NL的PSC和ORAC两种抗氧化能力都略高于NL。NL和CS-NL的CAA值显著高于甜菜红素,甜菜红素主要通过附着在细胞膜表面发挥抗氧化作用,而NL和CS-NL可进入细胞内部发挥抗氧化作用。采用亚甲基蓝法评价CS-NL的细胞毒性和抗增殖活性,并采用流式细胞术和实时荧光定量PCR(RT-q PCR)探究CS-NL的潜在抗增殖机理。结果表明,CS-NL和甜菜红素均能显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肝癌细胞Hep G2和人黑色素瘤细胞A375三种癌细胞的增殖,而CS-NL对三种癌细胞的抑制增殖效果比甜菜红素更强,细胞毒性也更大。CS-NL对A375细胞的抑制增殖效果最好,对MDAMB-231和Hep G2细胞次之,但对A375的细胞毒性也较大。以MDA-MB-231细胞为对象研究CS-NL的抗增殖机理,发现CS-NL可将MDA-MB-231细胞阻滞在G2/M期,并剂量依赖性地提高MDA-MB-231细胞的凋亡率,降低MDAMB-231细胞的线粒体膜电位,增加线粒体膜通透性并显著降低细胞内ROS水平。CS-NL可下调MDA-MB-231细胞内凋亡相关基因bcl-2和bcl-xl的表达,上调凋亡相关基因bax,cytochrome c和caspase 3的表达,提高bax/bcl-2的比值。说明其通过调节Bcl-2家族基因的表达,使细胞色素c释放至细胞质中,进而激活caspase级联反应,从而实现对线粒体介导的凋亡途径的调控来抑制MDA-MB-231细胞增殖。同时,CS-NL下调了细胞周期相关基因cyclin b1和cdc2的表达,降低了cyclin b1-cdc2复合体的活性,从而阻止细胞进入M期,通过将细胞阻滞在G2/M期以抑制MDA-MB-231细胞的增殖。
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