前言:喉癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤,严重危害人类的生命健康,临床流行病调查显示侵袭、转移是导致喉癌患者死亡的主要原因,因此,研究影响喉癌细胞迁移的分子机制具有重要的科学意义和潜在的临床价值。高迁移率族蛋白-1(high mobility group box-1,HMGB1)是一种高度保守的核蛋白。HMGB1通过与DNA结合,引起染色体结构改变,从而参与细胞核内复制、转录和染色质重塑等活动。研究表明,HMGB1参与乳腺癌、直肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、宫颈癌及卵巢癌等肿瘤细胞的迁移。本课题组研究发现HMGB1在喉癌中发挥癌基因作用(数据待发表),但具体机制尚不清楚。细丝蛋白A(filamin A,FLNA)是哺乳动物细胞中一种重要的细胞骨架蛋白,作为支架蛋白可以与90多种蛋白相互作用,表明FLNA可以通过多种信号通路行使功能,其中,最重要的是可以与波形蛋白(vimentin)相互作用影响细胞的粘附和迁移。据报道,FLNA与多种肿瘤的发生发展密切相关。有趣的是FLNA对肿瘤细胞迁移、侵袭具有双重调节作用,可能与其亚细胞定位有关:当FLNA定位于细胞核时发挥抑制肿瘤迁移、侵袭的作用,当定位于细胞质时则发挥促进肿瘤细胞迁移、侵袭的作用。经文献比对,我们发现在FLNA启动子区存在两个HMGB1结合位点。因此,我们推测FLNA作为下游基因介导HMGB1对喉癌细胞迁移的影响,且此效应与FLNA的亚细胞定位有关。本研究应用分子生物学技术统计分析FLNA在喉癌中表达与患者临床病理特征的相关性,并以人喉癌Hep-2细胞为研究对象,探讨HMGB1对FLNA的作用,阐明HMGB1通过FLNA对喉癌细胞迁移的影响,为深入探讨HMGB1和FLNA在喉癌发生发展中的临床意义提供科学依据。材料和方法:1、实验材料:喉癌组织及其对应癌旁组织、人胚肾细胞系HEK293和人喉癌细胞系Hep-2细胞。2、实验方法:细胞培养、细胞转染、细胞和组织总RNA和蛋白质提取、cDNA合成、Real-time PCR、Western Blot、免疫荧光、Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验。结果:1、Real-time PCR结果显示,30例喉癌组织中19例(63.3%)FLNA mRNA表达水平低于癌旁组织,平均mRNA表达量显著低于癌旁组织(P<0.01);喉癌Hep-2细胞中FLNA基因表达也显著低于HEK293细胞(P<0.05)。2、统计结果显示,FLNA与淋巴结转移、TNM分期和分化程度密切相关(P<0.05),而与患者年龄、性别等因素不相关(P>0.05)。3、划痕和Transwell检测结果显示,敲减FLNA后迁移距离和数量显著高于NC组及对照组,迁移能力显著升高(P<0.01)。4、Western Blot检测结果显示,敲减FLNA后E-cadherin蛋白表达水平较对照组降低(P<0.01),而N-cadherin、vimentin蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。5、Western Blot结果显示,敲减HMGB1后喉癌Hep-2细胞中FLNA的mRNA和蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05),提示在喉癌细胞中HMGB1可能负调控FLNA表达。6、免疫荧光结果显示,与对照组相比,敲减HMGB1后FLNA主要分布于细胞核,且核质比升高。7、细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,与NC组及对照组相比,敲减HMGB1后喉癌Hep-2细胞的迁移距离和数量显著减少,迁移能力显著降低(P<0.01);与HMGB1-si RNA组相比,同时敲减HMGB1和FLNA后喉癌细胞迁移能力显著升高(P<0.01),提示敲减FLNA可以逆转HMGB1-si RNA对喉癌Hep-2细胞迁移能力的抑制作用。结论:1、FLNA在喉癌中低表达,提示其在喉癌中发挥抑癌基因作用。2、FLNA具有抑制喉癌细胞迁移的作用,并抑制喉癌细胞上皮间质转化过程。3、HMGB1抑制FLNA在喉癌中的表达和核转位。4、HMGB1通过FLNA促进喉癌细胞的迁移。