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广泛分布在干旱和半干旱地区的荒漠植物,在漫长进化过程中形成了适应干旱的机制。这种适应进化机制是通过外界胁迫环境的长期刺激,促使植物基因组的基因表达发生改变或基因组的染色体发生变化来实现的。红砂是柽柳科红砂属超旱生小半灌木,是荒漠灌丛植被的主要优势种和建群种。由于红砂抗逆性强,生态可塑性大,具有很强的抗旱、耐盐、耐极端温度、耐辐射、耐贫瘠和集沙能力,因此红砂是研究抗逆机制不可多得的好材料,它将成为研究抗逆机制的重要基因组模式荒漠植物。本研究以超旱生荒漠植物红砂为材料,通过对兰州红砂进行细胞染色体核型分析,并与中卫和额济纳旗地区的红砂居群进行比较;测定红砂二倍体基因组大小;对随机分离的70个红砂基因片段进行序列构成分析和对ETR1基因信号途径的研究以及构建红砂分子进化树;旨在细胞分子遗传学水平上阐述红砂的干旱适应性。主要研究结果如下:
1.兰州红砂体细胞中期染色体数目是22,倍性为二倍体;红砂染色体的变化范围为3.38±0.35 to5.51±0.94μm,染色体总长为98.35μm,平均染色体的长度为4.47μm,属中等类型染色体;核型公式为2n=2X=22=4m+16sm+2st;染色体的不对称系数为67.42,属于较对称类型;染色体类型属于“3A”型。45S rDNA在红砂二倍体的22条染色体上有4对杂交信号,2对强,2对弱,且都位于染色体短臂的末端;在两对弱杂交信号中有一对杂交信号强弱不一样。
2.兰州、中卫和额济纳旗三个区域红砂染色体数目及倍性明显不同。分布在水分条件相对最好的兰州地区,所有红砂居群的染色体都为二倍体;在水分条件相对较差中卫地区,既有二倍体红砂居群也有三倍体红砂居群;在极端干旱区额济纳旗,红砂居群主要为三倍体,同时也有一定比例的四倍体非整倍体红砂。红砂二倍体和三倍体的45S rDNA染色体位置是一致的,都位于染色体的末端,但45S rDNA位点数及45S rDNA信号强度、大小不同:二倍体的45S rDNA杂交信号为8个,三倍体为11个,且二倍体的杂交信号强度明显强于三倍体。
3.红砂二倍体基因组C值为0.806 pg,预期基因组大小为778 Mb,约是水稻基因组大小的2倍。玉米的1/3,红砂基因组是相对的教小。
4.针对红砂叶片组织富含多糖多酚的特点,改进的CTAB-DNase-NaAc法采用醋酸钠及无水乙醇去除多糖,酚/氯仿反复抽提去除蛋白,DNaseⅠ去除DNA,LiCl有效沉淀RNA。此法提取的RNA条带清晰,经紫外光谱分析D260/D280比值为2.013,D260/D230为2.120,电泳28S、18S条带清晰,比值约为1.8。RT-PCR结果表明:改进的CTAB-DNase-NaAc法提取的总RNA可直接用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验;而且该方法也适合从其它荒漠植物中提取分离高质量的总RNA,因此该方法有广泛的实用价值。
5.通过对红砂ETR1乙烯受体基因的研究,得到了602 bp的ETR1乙烯受体基因片段。其序列与其它植物的相应序列进行blastp比对,结果显示与海棠(Malusdomiestica,AF032448.1))和梨(Pyrus pyrifolia,EU021507.1)的ETR1乙烯受体基因都表现出74%的同源性;Blastp比对,发现ETR1 cDNA序列编码的蛋白两端分别有组氨酸激酶A结构域(HisKA)和类组氨酸ATP酶(HATPase_c)的保守结构域,进一步证实该基因为ETR1乙烯受体基因。半定量PCR实验表明,ETR1乙烯受体基因受环境胁迫的诱导,随着大气湿度的减少,ETR1乙烯受体基因的表达量大大累积,说明ETR1乙烯受体基因信号途径在红砂抗旱中起相当重要的作用。
6.通过改进的RT-PCR和SON-PCR进行随机基因片段扩增,最终获得了70条序列,其中19条EST序列和为51条GSS序列,GenBank登录号分别为GW820236-GW820254,GS927772-GS927822。对这70条来自红砂的EST序列和GSS序列进行了重复序列分析,结果表明红砂并没有高比例的重复序列,相反红砂重复序列的比例较低,比例仅为4.45%。70条序列中仅包含一个简单重复序列和4个LTR重复元件,由3个3 Gypsy/DIRSIs和1 Ty1/Copia构成;Blast序列比对发现,有12条序列GSS(近24%)能与SWISS-PROT蛋白序列比对上(E<1e-7),8条EST序列能与SWISS-PROT蛋白序列比对上;
7.16S DNA基因构建的分子系统进化树表明:总体上来说,红砂与所有双子叶植物的进化距离比与所有单子叶植物的进化距离要近;其中红砂(R。soongorica)与高丽人参(Panax ginseng)聚在同一层中,与高丽人参(Panaxginseng)的进化关系是最近的;与向日葵(Helianthus annuus)聚成一族,进化关系较近,与单子叶植物小麦(Triticum aestivum)的进化距离是最远的。
总之,以上结果表明红砂是一个原始种,属于古老的第三纪残遗植物,其二倍体所具有的强抗旱性并不需要大而复杂的基因组结构;红砂通过不断改变染色体包括染色体加倍或改变染色体的数目并进行基因组重组来适应极端环境的胁迫特别是极端干旱环境的胁迫。