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研究目的:探讨不同氧化还原状态下结核性肉芽肿的形成和发展情况,并分别从单核巨噬细胞的极化改变、细胞因子产生、活性氧（ROS）水平改变,以及淋巴细胞的分化、活化水平和趋化活性等方面探讨不同氧化还原状态影响肉芽肿形成的机制。研究方法:1、参照文献及实验室前期建立的方法采用牛型结核分枝杆菌减毒疫苗株BCG感染人外周血单个核细胞（PBMC）建立体外结核性肉芽肿模型。在模型构建之前分别用N-乙酰半胱氨酸（NAC）和丁胱亚磺酰亚胺（BSO）预处理PBMC2h,以改变细胞的氧化还原状态,然后用BCG感染PBMC建立体外肉芽肿模型,分别在感染后的不同时间点观察肉芽肿的形成情况,进行肉芽肿计数并拍照记录。2、分别从以下方面探讨不同氧化还原状态影响体外肉芽肿形成的机制:（1）采用流式细胞术检测单核巨噬细胞表面极化分子CD40、CD64、CD163、CD206的表达情况,以了解不同氧化还原状态对单核巨噬细胞极化的影响。（2）采用ELISA方法测量不同处理组细胞培养上清中TNF-α,IFN-γ和IL-10的表达水平;通过流式细胞术检测单核细胞胞内TNF-α的表达情况,以了解不同氧化还原状态对模型细胞产生细胞因子的影响。（3）采用流式细胞术检测单核细胞的ROS产生水平,以了解不同氧化还原状态对单核细胞反应性氧产物产生的影响。（4）分别用模拟物或抑制物上调或下调各组细胞的ROS水平,观察体外肉芽肿的形成情况,以进一步确认ROS水平对肉芽肿形成的影响。（5）采用流式细胞术分别检测T淋巴细胞表面CD4、CD8的表达情况,了解不同氧化还原状态对T细胞向不同亚群分化的影响;检测CD4+T细胞胞内IFN-γ和IL-4的产生水平以及T淋巴细胞表面CD69的表达情况,以了解不同氧化还原状态对T淋巴细胞活化的影响。（6）采用transwell小室法,以BCG为趋化源,检测不同氧化还原状态对淋巴细胞和单核细胞向BCG趋化能力的影响;以淋巴细胞为分析细胞,观察感染后的单核细胞对淋巴细胞趋化活性的影响。3、在动物实验水平探讨氧化还原状态对结核性肉芽肿形成的影响:先采用NAC通过腹腔注射途径对小鼠进行预处理,再采用结核分枝杆菌（MTB）H37Rv通过雾化吸入法分别感染NAC预处理后的C57BL/6小鼠和对照C57BL/6小鼠,建立结核病小鼠模型,然后分别在感染后的不同时间点解剖小鼠,观察肺组织的大体改变并拍照记录肉芽肿结节形成情况,同时取部分肺组织浸泡于多聚甲醛固定,行石蜡切片后进行HE染色观察肺组织的病理改变。研究结果:1、各组PBMC经BCG感染后,均于第2天起开始形成细胞聚集团,于第3天形成典型的肉芽肿样结构。BCG感染后第3天时,与未预处理对照组比较,NAC处理组PBMC在BCG感染后形成的肉芽肿数量显著增多（38.25±0.85/LPF vs 54.00±1.08/LPF,P<0.05）。相反地,BSO预处理组PBMC在BCG感染后形成的肉芽肿数量与未预处理对照组比较显著减少（38.25±0.85/LPF vs26.50±0.65/LPF,P<0.05）。随着感染时间的延长,各组细胞产生的肉芽肿的体积逐渐增大,但肉芽肿的数量不再显著改变。2、氧化还原状态对单核巨噬细胞极化表型的影响:（1）与不感染对照组相比,BCG感染后24h单核巨噬细胞的极化表型趋向于向M1方向极化。（2）与未预处理的BCG感染组比较,NAC预处理可显著下调单核巨噬细胞表面M1极化表型的分子表达,对M2极化表型分子的表达无显著影响;BSO预处理则显著上调单核巨噬细胞表面M2极化表型分子的表达,对M1极化表型分子的表达无显著影响。3、氧化还原状态对单核细胞产生TNF-α的的影响:与正常对照组相比,BCG感染组CD14+单核细胞胞内TNF-α的表达水平显著升高,但NAC和BSO预处理对单核细胞产生TNF-α的水平无显著影响。4、氧化还原状态对单核细胞产生ROS水平的影响及其对结核性肉芽肿形成的影响:（1）与正常对照组相比,BCG感染组ROS的产生水平显著增加;NAC预处理组与未预处理组细胞比较,BCG感染后产生的ROS水平显著降低,而BSO预处理则可显著上调BCG感染后单核细胞的ROS水平。（2）采用NADPH氧化酶抑制剂DPI阻断胞内ROS的生成可显著促进BCG感染诱导的肉芽肿形成,而采用H2O2上调ROS的水平则可显著抑制肉芽肿的形成。（3）在NAC预处理后,再外源性给予H2O2以上调培养体系中的ROS水平,可部分抵消NAC促进结核性肉芽肿的作用,但较单纯H2O2处理组形成的肉芽肿数量显著增加。5、氧化还原状态对T淋巴细胞分化的影响:与单独感染组比较,NAC和BSO预处理对BCG感染后的PBMC中CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比值,以及CD3+CD4+T细胞中Th1/Th2细胞亚群的比值均无显著影响。6、氧化还原状态对T淋巴细胞活化水平的影响:NCA/BSO预处理,与单独感染组对比CD69表达水平均无显著差异。7、氧化还原状态对细胞培养体系中细胞因子水平的影响:与正常对照组相比,BCG感染组TNF-α、IFN-γ和IL-10的表达水平均显著升高;NAC预处理组,与单独感染组对比TNF-α和IFN-γ的表达均下降,IL-10的表达无差异;BSO预处理组,与单独感染组对比这三种细胞因子的表达均无统计学差异。8、氧化还原状态对细胞趋化活性的影响:（1）以PBMC为待分析细胞,以BCG为趋化源时,与未预处理组相比,NAC预处理显著抑制单核细胞和淋巴细胞的趋化活性;BSO预处理,对单核细胞和淋巴细胞的趋化活性无显著影响性。（2）以纯化的淋巴细胞为待分析细胞时,BCG感染的单核细胞趋化淋巴细胞的能力显著强于单独的BCG和未感染的单核细胞。9、各组小鼠经MTB感染8w后,肺部均出现肉眼可见的结节状肉芽肿。与未进行处理的小鼠比较,NAC处理组小鼠肺部的肉芽肿不仅数量增多,且体积明显增大。小鼠肺组织经HE染色后可见NAC处理组小鼠肺部炎性细胞的浸润较单纯BCG感染组显著增加,肉芽肿样炎细胞的聚集也显著增多,肺组织病理改变更加严重。结论:1、氧化还原状态可显著影响结核性肉芽肿的形成,抗氧化剂NAC可促进结核菌诱导的体外肉芽肿的形成,主要表现为肉芽肿数量上的增加;也可促进结核病小鼠肺组织内结核性肉芽肿的形成及灶状炎细胞的浸润,但可加重小鼠肺组织的病理损伤。2、NAC促进肉芽肿形成的机制可能与其下调单核细胞的ROS水平相关,与单核巨噬细胞的极化、细胞因子的产生水平、淋巴细胞的分化和活化水平均没有显著的相关性。