双组分系统(TCS)是细菌重要的信号传导系统，在细菌迅速响应外界信号的过程中扮演主导角色。典型的TCS由组氨酸蛋白激酶（HK）和应答调控蛋白(RR)2种组分构成，它们的编码基因在基因组上前后排列。大量研究表明，TCS在重要工业微生物-链霉菌的次级代谢及形态分化发育中发挥着关键的调控作用。但是，以前的研究主要聚焦于典型TCS，而关于非典型TCS，如孤立HK和RR的研究则较少，尤其对于孤立HK的信号通路上是否存在匹配的RR、作用机制是否有别于典型TCS等方面知之甚少。因此，开展相关研究具有很好的创新性，并且对于全面理解并丰富双组分系统介导的调控机制具有重要意义;同时，也为链霉菌的代谢工程改造以提高重要抗生素的发酵产量亦或发掘新的链霉菌来源的天然产物提供理论指导。　　在前期研究工作中，我们首次在模式菌-天蓝色链霉菌M145中鉴定了一个新的参与次级代谢和形态分化发育全局调控的孤立HK，命名为OhkA（Orphan histidine kinase，SCO1596）。该HK编码基因ohkA的缺失导致抗生素放线紫红素(ACT)、灵菌红素（RED）以及钙依赖抗生素(CDA)等过量产生，形态分化异常，包括菌落表面呈现粉红色、气生菌丝减少、不产孢子或仅形成非常短的孢子链。为了深入解析OhkA介导的分子调控机制，本论文开展了以下研究工作:　　1)鉴定与OhkA匹配的下游RR。与孤立HK匹配的RR往往也是孤立的，同时，由于它们处于同一信号通路上，因此，它们的缺失突变体会呈现一致的表型变化。为寻找与OhkA匹配的下游RR，本研究构建了天蓝色链霉菌中所有未知功能孤立RR的基因缺失突变体，并进行表型筛选（观察形态分化以及抗生素产量的变化）。结果显示，在MS和R2YE培养基条件下，孤立RR基因SCO3008的缺失突变体出现与ohkA突变体（△ohkA）完全一样的表型变化，如ACT与RED的产量大幅提升，形态分化异常、产孢减少、菌落表面呈现粉红色等。将SCO3008基因及其上游启动子区域导回突变体可以恢复表型变化。这些结果预示，SCO3008编码的孤立RR OrrA（Orphan Response Regulator）可能是与OhkA匹配的下游RR。　　为了进一步验证OhkA与OrrA之间的匹配关系，本研究对ohkA与orrA分别缺失引起的转录谱差异的一致性进行分析。如果OhkA与OrrA匹配成对，组成双组分系统(TCS)，那么它们的缺失突变体应该呈现一致的转录谱差异。结果显示，如预期那样，2个缺失突变株的转录谱差异非常一致，差异相关系数高达97.6％。△ohkA和△orrA中发生转录变化的基因分别有4505个（上调2344个，下调2161个）和4600个（上调2292个，下调2308个），二者共同上调1967个，共同下调1923个。这预示两种蛋白确实是位于同一条信号通路上。　　双组分系统中HK与其匹配的RR是通过磷酸化转移进行信号传导，因此，为了证明OhkA与OrrA之间的直接相互作用，本研究首先使用经典的磷酸转移实验予以验证。但遗憾的是，在测试条件下，OhkA无法发生自身磷酸化，导致实验失败。为此，我们采用了替代方案，即细菌双杂交实验。结果显示，与对照组相比，含有ohkA与orrA基因的实验组呈现阳性反应，证明二者之间确实存在相互作用。　　综合表型分析、转录谱差异一致性以及细菌双杂交实验，可以断定OrrA与OhkA匹配成对，组成TCS。如前所述，经典TCS中HK与RR的编码基因在基因组上前后排列，并且往往是共转录。与之相比，由OrrA与OhkA组成的TCS，其编码基因相隔较远，转录差异较大，这种类型TCS如何进化形成的、其生物学意义是什么等问题值得进一步深入研究。　　2)OrrA直接调控下游靶基因的鉴定。根据芯片结果，挑选转录变化最为显著的一系列基因，将其启动子做成Cy5探针，通过凝胶阻滞实验(EMSA)寻找OrrA的直接作用靶点。目前，初步筛选到一个可能受OrrA直接调控的下游靶基因bldD，编码的BldD广泛存在于放线菌中，是一种影响形态分化和抗生素生物合成的全局性调控因子，其活性受到第二信使c-di-GMP的调节。之后，我们还尝试通过染色质免疫功共沉淀(ChIP)的方法寻找下游靶基因，目前还在进行中。　　3)OrrA功能拆分研究。OrrA功能多样性主要取决于它的DNA结合结构域。为了实现其功能拆分，本研究对OrrA蛋白的DNA结合结构域（共56个氨基酸）进行突变，并将突变的orrA基因导入△orrA，通过观察表型变化，研究不同氨基酸突变对OrrA功能的影响。首先，我们尝试将每五或六个连续的氨基酸分为一组，均突变成丙氨酸，共有11组。表型分析结果显示，所有回补菌株的抗生素过量产生的表型均没有回复，但有趣的是，第五组回补菌株的形态分化回复成野生型。接着，将第五组的5个氨基酸进行单突变，结果显示，单独突变的回补菌株呈现出与组合突变菌株一致的表型变化。由此，我们成功实现了OrrA调控蛋白的功能拆分，从而为后续链霉菌工业高产菌株的构建提供了很好的功能元件。　　除了开展孤立RR OrrA分子调控机制的研究以外，本论文还构建了一株高产RED的工程菌株。随着对新药需求的增加，一些过去已知的细菌次级代谢产物重新被关注。其中，细菌灵菌红素（包括RED及其类似物）具有抗肿瘤、抗疟疾、免疫抑制剂等诸多生物活性，由沙雷氏菌、弧菌以及链霉菌等细菌产生，在医药工业领域具有重要应用价值。目前，灵菌红素产量最高的产生菌是粘质沙雷氏菌，高达49.5g/L，但它的条件致病性限制了其在工业生产的应用。因此，链霉菌作为一类传统工业用菌株，可能更适合于大规模生产和优化。基于此，本研究以△ohkA为出发菌株，运用组合代谢工程策略，包括其他抗生素（如ACT与钙依赖抗生素CDA）生物合成基因簇(BGC)的缺失以及RED合成基因簇的多拷贝整合，构建了一株高产RED的工程菌株。　　以△ohkA为出发菌，我们相继敲除ACT和CDABGCs。需指出的是，为了实现后续多拷贝整合RED BGC，在ACT和CDA BGCs敲除的位置同时引入ΦC31attB位点，分别得到菌株SBJ102（敲除ACTBGC并引入一个人工attB位点）和SBJ103（敲除ACT和CDABGCs并引入两个人工attB位点）。工程菌株的RED产量相比M145分别增加1.9倍和6倍。将完整RED BGC分别导入SBJ101-SBJ103，得到菌株SBJ104-SBJ106（分别整合1至3个RED BGC的拷贝）。最终的工程菌株SBJ106的RED产量最高，可达96.8mg/g cdw，相比M45增加了近12倍。这些结果表明，本研究中采用的组合代谢工程策略对于灵菌红素高产菌株的构建非常有效。