研究背景：软骨单位（chondron）作为近年来逐渐重视的关节软骨的基本功能结构，其主要由细胞周基质（pericellular matrix，PCM）与包裹在内的一个或几个软骨细胞构成。由于PCM为介于软骨细胞与细胞外基质（extracellar matrix，ECM）之间的环形基质条带，理论上成为软骨细胞与ECM交通的重要“媒介”，就关节软骨单位特别是PCM在软骨细胞代谢及力学传导中的作用，逐渐引起人们的重视。包括我们前期的大量研究表明，随年龄增长及骨关节炎时，关节软骨细胞生物力学及代谢能力发生明显的退变。通过对不同年龄软骨单位的酶解消化及体外培养组织形态学、生物力学及代谢特点的系统分析，对了解软骨单位在关节软骨退变机制中的作用及其作为组织工程软骨种子细胞的生物学优势具有积极的意义。研究目的：①与软骨细胞比较，系统分析幼、中、老不同年龄软骨单位体外酶解消化组织形态学特点，建立和完善软骨单位体外酶解消化实验方法；②与软骨细胞比较，分析幼、中、老不同年龄软骨单位生物力学变化特点，探讨软骨单位在关节软骨退变力学机制中的作用；③与软骨细胞比较，分析软骨单位体外培养过程中组织形态学、增殖及基质合成代谢水平的变化特点，完善软骨单位体外生物学特性分析。研究内容：本课题进行了以下三项相关研究。①不同年龄兔膝关节软骨单位体外酶解消化组织形态学分析：取新西兰白兔30只，按年龄分为3组：幼年组（2月龄）、中年组（8月龄）及老年组（31月龄），各10只。每组5只兔子10膝进行原位组织切片形态学观察，包括HE、甲苯胺蓝及Ⅱ、Ⅵ型胶原免疫荧光染色观察分析；采用real time-PCR的方法分析不同年龄软骨细胞糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAG）和Ⅱ型胶原(collagen-typeⅡ，Col-2)mRNA的表达。同时，采用0.3% dispase酶和0.2% II型胶原酶联合搅拌消化3h的方法获取不同年龄兔膝关节软骨单位，采用HE、Ⅵ型胶原免疫荧光染色等方法观察分析不同年龄软骨单位体外组织形态学特点。②不同年龄兔膝关节软骨单位体外微管吸吮黏弹性力学分析：按第一部分的酶解实验方法，分别获取幼、中、老不同年龄兔膝关节软骨细胞和软骨单位。利用微管吸吮结合半无限体细胞力学模型定量分析急性消化不同年龄软骨细胞及软骨单位黏弹性力学特性，包括平衡模量E6、瞬间模量E0和表观黏性μ等黏弹性参数。同时，利用激光共聚焦显微镜观察、real time-PCR及western-blotting等技术方法分析不同年龄软骨细胞细胞骨架分布和含量的变化特点。③兔膝关节软骨单位体外培养生物学特性分析：在前期研究的基础上，酶解消化分别获取幼年（2月龄）新西兰兔膝关节软骨细胞和软骨单位，均进行体外贴壁单层培养1、3、6、9天，通过HE、Ⅵ型胶原免疫荧光染色观察分析软骨细胞及软骨单位的形态学变化；通过MTT法检测软骨细胞与软骨单位的增殖情况；通过real time-PCR的技术分析软骨细胞及软骨单位体外培养过程中GAG、Col-2、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase，MMP-3)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA表达。收集上清液通过Elisa技术分析软骨细胞及单位不同时间GAG、Col-2、MMP-3及TIMP-1的上清液分泌含量。研究结果及结论：①随年龄增长关节软骨结构和形态发生退行性变化的同时，膝关节软骨单位原位组织形态学发生明显的变化。其中，软骨细胞周围PCM界限随年龄增长逐渐清楚，软骨深层内出现大量由PCM基质包裹纵向排列2～4个软骨细胞的软骨单位形态。与单纯软骨细胞相比，体外酶解消化软骨单位PCM成分明显、完整，且较好保留了不同年龄关节软骨单位原位组织形态学的特点。②不同年龄关节软骨细胞均表现出典型的黏弹性固体蠕变特征，但随年龄增长，其黏弹力学特性逐渐下降；同时，随年龄增长，细胞骨架排列结构及含量发生明显变化，提示其在软骨细胞力学维持方面的作用。软骨单位作为一个整体单元结构，可实现体外微管吸吮黏弹性分析，表现为黏弹性固体特性，但其力学特性较单纯软骨细胞明显提高，提示PCM在软骨细胞力学微环境维持中作用；随年龄增长，软骨单位黏弹性逐渐增高，提示软骨单位在关节软骨发育成熟与退变力学机制中的作用。③软骨单位体外贴壁单层培养过程中，早期由于PCM的存在，软骨单位增殖较慢；后期PCM基质逐渐降解消化后，软骨单位开始像软骨细胞一样快速分裂增殖，提示软骨单位体外培养保留了软骨细胞较好的增殖潜力。在体外贴壁单层培养过程中，软骨单位GAG、Col-2等基质成分mRNA表达水平较单纯软骨细胞增高，且基因表达功能退变较慢。同时，在软骨单位较同期软骨细胞增殖数量较少的情况下，其上清液中GAG、Col-2分泌量与软骨细胞无明显差异，且随培养时间的延长逐渐升高。同时，软骨单位上清液MMP-3炎症因子表达量降低，且其拮抗因子TIMP-1含量升高，提示其作为组织工程化软骨种子细胞的优势。