我国畜禽养殖业逐步从分散式养殖向集约化转变,抗生素作为生长促进剂、细菌性疾病治疗药物被广泛用于畜禽养殖业中,而抗生素的不合理使用导致细菌耐药性的增强和耐药基因的扩散,给公众健康带来危害。粪肠球菌是引起人或动物感染性疾病的主要病原之一,而恶唑烷酮类抗生素是治疗万古霉素耐药肠球菌的“最后一道防线”,对其耐药性进行监测具有重要卫生意义。本课题旨在调查浙江省内生猪养殖场中微生物的菌群结构及抗生素耐药情况,探讨质粒介导的恶唑烷酮类耐药基因optrA在粪肠球菌中的水平传播机制。主要研究结果如下:1.从浙江省杭州、宁波、金华、衢州和温州五个地区采集了15家生猪养殖场的猪粪便样品进行宏基因组测序,对微生物菌群结构、抗生素耐药性、耐药基因的丰度与潜在宿主、地区间菌群差异以及ARGs差异进行了分析。在微生物结构分布上,细菌是浙江省生猪养殖场的主要微生物,占比90%以上;在属水平上,以肠球菌属、嗜冷杆菌属和埃希氏菌属等菌属为主。非度量多维尺度分析（NMDS）显示在同地区样品物种分布具有一定的相似性。在抗生素耐药性上,本次分析共匹配到176种耐药基因对应70种抗生素,五个地区样品共享71种耐药基因,丰度最高的3种耐药基因是氯霉素类耐药基因cml,磺胺类耐药基因sul2,杆菌肽类耐药基因baca,五个地区间大环内酯类耐药基因cml、多药耐药基因mexf、四环素耐药基因tet K、氨基糖苷类耐药基因aph3ib和甲氧苄啶耐药基因dfra17的丰度存在显著性差异（p＜0.05）。通过物种与耐药基因贡献度分析,发现不动杆菌（Acinetobacter）是磺胺类耐药基因sul2的潜在宿主;大肠埃希氏菌属、肠球菌属、葡萄球菌属、嗜冷杆菌属等菌属是杆菌肽类耐药基因baca的主要潜在宿主。通过构建网络共现图,对肠球菌与耐药基因之间的相关性进行分析,发现肠球菌与磺胺类耐药基因sul、大环内酯类耐药基因cml等耐药基因呈现负相关性,与杆菌肽类耐药基因baca、四环素类耐药基因tet、和外排泵耐药基因acr呈正相关。2.利用MIC药敏实验和PCR技术探究粪肠球菌的耐药表型构成及耐药基因型分布情况,以此评估浙江省生猪养殖场中粪肠球菌的耐药性水平及差异。从浙江省545份粪便样品中检出肠球菌406株,总分离率为74.50%,其中粪肠球菌226株。MIC药敏实验表明,226株粪肠球菌对近57%（8/14）的常用抗生素耐药率高于50%,耐药率最高的是截短侧耳素类抗生素泰妙菌素,耐药率为98.23%,替米考星、红霉素、四环素和氟苯尼考耐药率均高于80%,且恶唑烷酮类抗生素利奈唑胺耐药率为38.49%。多重耐药菌（3R-14R）比例高达98%,不同地区来源的肠球菌以7R-10R为主,占比超过了50%。总体耐药情况上杭州、衢州、金华的耐药情况比沿海城市宁波、温州的耐药情况更严重。恶唑烷酮类耐药基因以optrA为主,检出率为71.68%,poxt A检出率7.08%,未检出cfr和cfr（B）基因,杭州地区optrA检出率显著高于宁波地区（p＜0.05）。酰胺醇类耐药基因以optrA和fex A为主,且optrA常与fex A共同存在于菌株中。3.通过多位点序列分型、接合转移、复制子分型、质粒测序等方法,研究恶唑烷酮类耐药基因optrA在猪源粪肠球菌中的传播机制。MLST分子分型实验表明optrA耐药基因在粪肠球菌中主要以水平基因转移的方式进行水平传播。通过接合转移实验表明部分菌株optrA基因位于质粒上并具有可移动性,经质粒复制子分型实验发现,Rep A-N型质粒是携带optrA耐药基因的主要类型。质粒p HZ318-optrA含有2个外源插入区,均为多药耐药区（MDR）。通过对p HZ318-optrA质粒中optrA耐药基因的侧翼序列与遗传环境分析发现:optrA与fex A耐药基因共存于IS1216E-fex A-optrA-ferr-erm（A）-IS1216E复合转座子中,下游存在Tn554转座子的部分完整序列,赋予了菌株对大环内酯类和链霉素的抗性。而p NB304-optrA中仅发现了一个插入序列ISVlu1,未发现转座子等其他移动元件。综上所述,杭州地区生猪养殖场微生物菌群结构比宁波地区更复杂,抗生素种类和耐药基因种类更丰富,肠球菌是各生猪养殖场的优势菌群之一,是baca等耐药基因的潜在宿主;杭州地区optrA检出率显著高于宁波地区,optrA常与fex A共存,猪源粪肠球菌中optrA基因主要以Rep A＿N型质粒介导并通过IS1216E和Tn554等可移动遗传元件在菌株之间发生水平传播;Rep A-N型质粒p HZ318-optrA比Rep3型质粒p NB304-optrA在粪肠球菌中稳定性更好,存在更多的可移动元件,传播能力强。本课题可为生猪养殖业科学使用抗生素提供理论依据,为减缓多重耐药肠球菌的发展以及探索新的耐药控制策略提供科学指导。