研究背景肌动蛋白样-6a(ACTL6a)也被称为BAF53a或者Arp4,是ATP依赖性SWI/SNF样BAF染色质重塑复合物的主要成员之一。首先在T淋巴细胞BAF复合体内被鉴定为肌动蛋白相关蛋白,定位于核染色体,特别是富含常染色质的区域,ACTL6a涉及广泛生物过程,为染色质重塑、基因转录调控、核转位等。2017年Srinivas Vinod Saladi等学者发现ACTL6a和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中的P63物理相互作用共扩增,协同调节关键基因,包括WWC1,激活Hippo-YAP途径,促进增殖、抑制分化,肿瘤预后不良。2016年Xiao Shuai等学者发现ACTL6a通过SOX2/Notch1信号传导促进肝细胞癌(HCC)转移和上皮-间充质转化(EMT)。2013年Bao Xiaomin等学者发现ACTL6a可以抑制SWI/SNF诱导的KLF4以维持表皮干细胞干性。近年来研究发现:ACTL6a抑制细胞分化,维持自我更新和多能性的功能作用(包括胚胎干细胞、表皮干细胞及造血系统中的祖细胞)。银屑病是慢性复发性炎症性增殖性皮肤病,影响全球2-3%的人口,约1.25亿人,伴有一定并发症,如关节炎、心血管疾病、代谢综合征(血脂异常和糖尿病)、慢性肾病、胃肠疾病、带状疱疹、感染、心境障碍、恶性肿瘤和肺部疾病。典型临床表现为红斑、鳞屑,常见的病变部位包括头皮、膝盖、肘部的伸侧、躯干、小腿前部和指甲。全球每年约花费近百亿美元用于银屑病患者的护理。银屑病患者承受着巨大的心理负担,体力活动、认知功能、生活质量降低。一项meta分析报道了三甲医院中28%的银屑病患者有抑郁症状。银屑病的发病机制包括遗传环境等因素。高达30%的银屑病患者可以找到相似疾病史的亲属。表皮角质形成细胞的异常增殖被认为与银屑病的发生发展有着密切联系。一般表皮角质形成细胞从基底层到角质层需要约28天,而在银屑病患者身上,表皮通过时间仅需3-5天。在组织病理上,可以明显观察到角化过度,角化不全,伴随棘层杵状增生肥厚及颗粒层减少或缺失。研究显示,银屑病皮损处同时含上皮和间充质标志物,属于EMT的2型中间表型。创伤修复是时空高度精密复杂过程。创伤修复的细胞生物学基础依赖于表皮细胞快速增殖、迁移及分化,同时需众多的细胞因子维持细胞存活和增殖,从而共同促进创面修复。角质形成细胞是构成表皮结构主要细胞。Ivor J.Lim等学者研究表明,上皮和间质之间以旁分泌、自分泌等形式相互影响,DanielN等学者报道:表皮在创伤修复过程中对成纤维细胞可能起到了一定的调控作用。ACTL6a在维持表皮干性(增殖、迁移)及EMT方面有着不容忽视的作用,与银屑病的发病机理及创伤的修复机理有着一定程度的重叠,促使我们思考ACTL6a是否参与银屑病的发生,在其中发挥了什么作用?对于预测银屑病的进展与预后有着什么作用?ACTL6a在皮肤创伤修复过程中起到什么作用?在查阅文献基础上,尚未有ACTL6a的体内实验研究。我们构建ACTL6a转基因小鼠,以期通过体内实验进行深入探索,得出一定的理论基础。目的阐明ACTL6a在正常和银屑病皮肤中的定位;明确ACTL6a在正常和银屑病皮肤体外培养KCs中表达量;构建ACTL6a转基因小鼠;研究ACTL6a转基因小鼠表皮功能变化;分别构建银屑病和创伤小鼠模型,探索ACTL6a在银屑病样小鼠模型中的创伤小鼠模型中的生物学作用。方法获取正常人和银屑病患者的皮肤样本,原代培养KCs。IHC、IF探索ACTL6a在正常和银屑病皮肤中的组织定位。分离培养的正常及银屑病KCs,提取RNA及蛋白质,qRT-PCR、western blot方法测定其ACTL6a在mRNA和蛋白质水平的表达。构建ACTL6a转基因小鼠模型,提取足趾DNA、PCR扩增鉴定、表皮western blot实验验证ACTL6a转基因小鼠的构建。通过qRT-PCR方法研究ACTL6a转基因小鼠表皮功能变化。以C57BL/6小鼠及ACTL6a转基因小鼠为研究目标,构建IMQ诱导的银屑病样小鼠模型,对皮损进行PASI评分,统计两组皮肤厚度变化,皮损区组织通过H&E和Masson染色进行表皮厚度与血管面积等病理观察,通过qRT-PCR方法测定皮损处组织炎症因子表达,获取淋巴结和脾脏进行流式检测,研究ACTL6a在银屑病中的作用。以C57BL/6小鼠及ACTL6a小鼠为研究对象,构建小鼠创伤模型,统计两组皮肤创伤面积及创伤愈合率,HE和Masson进行皮损区组织病理观察,通过qRT-PCR方法测定皮损处组织细胞外基质表达,研究ACTL6a在创伤中的作用。结果一、ACTL6a在正常和银屑病皮肤组织及体外培养KCs的中的定位和表达。1.IHC及IF实验显示,ACTL6a在正常皮肤组织和银屑病皮损区表皮均有明显的表达,银屑病患者内表达高于正常人。2.在mRNA及蛋白水平上验证,银屑病皮损区KCs中ACTL6a的表达均较正常KCs表达上调。二、ACTL6a转基因小鼠模型的构建鉴定及其在转基因小鼠表皮功能研究1.对赛业公司构建的ACTL6a转基因小鼠,在足趾DNA及表皮蛋白水平上验证,结果均提示ACTL6a转基因小鼠构建成功。2.在mRNA水平上,与C57BL/6小鼠表皮相比,ACTL6a转基因小鼠表皮中增殖相关基因KRT16明显升高,KRT6与KRT17无统计学差异;衰老相关的p53、p21明显降低,p27无统计学差异;周期相关的CyclinB1明显升高,CyclinD1和cdk2无统计学差异。结果提示,ACTL6a可促进小鼠表皮增殖,同时抑制其衰老的发生。三、ACTL6a转基因小鼠银屑病样模型和创伤模型研究1.ACTL6a转基因小鼠,与C57BL/6小鼠相比,在IMQ诱导的银屑病样模型中,表现出相对严重的银屑病样皮损,组织病理提示表皮增厚及血管增生均较多。与C57BL/6小鼠相比,ACTL6a转基因小鼠淋巴结及脾脏中CD3+CD8+ T细胞、CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg 细胞均下降,CD3+CD4+ T 细胞、MHC+DCIR2+ DC、CD 11c+CD207+ DC无明显差异。ACTL6a转基因小鼠背部皮损组织炎症相关IL-23、IL-17A、TNF-αmRNA水平明显升高。2.ACTL6a转基因小鼠,与C57BL/6小鼠相比,环钻构建的皮肤创伤修复模型中,呈现较快的修复速度,组织病理提示伤口周围表皮层数较多,有大量细胞向创面迁移;皮损处组织细胞外基质(Collagen la、Collagen la、MMP-3)mRNA水平上表达上升。结论1.ACTL6a在正常人和银屑病患者的表皮均有表达,银屑病患者内的表达高于正常人。2.ACTL6a在银屑病患者皮损组织来源的KCs内的表达高于健康者皮肤组织的 KCs。3.成功构建ACTL6a转基因小鼠。4.表皮过表达ACTL6a影响表皮增殖、衰老功能。5.过表达ACTL6a的转基因小鼠中,ACTL6a对IMQ诱导的银屑病样皮损起到加重作用;促进创伤修复。ACTL6a在银屑病和创伤中发挥作用所涉及的具体机制通路的研究不够深入是本课题的局限。