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目的t(9;22)(q34;q11)导致Abl基因和Bcr基因发生融合,产生的BCR/ABL融合蛋白是慢性髓细胞白血病(CML)的发病原因,该蛋白主要定位在细胞浆中,其强烈的非受体酪氨酸激酶活性可通过激活下游多条信号通路促进血细胞恶性转化。采用将BCR/ABL蛋白诱导入核策略,可增加CML细胞凋亡。因此,进一步研究BCR/ABL蛋白在细胞内定位的机制具有重要意义。FABD结构域(F-actin binding domain,FABD)是位于BCR/ABL蛋白上ABL端的大片段非催化结构域,该结构域可与细胞骨架蛋白F-actin相互结合,从而影响蛋白细胞定位。如果将c-Abl蛋白上FABD结构域缺失(以ΔFABD表示),部分c-ABL-ΔFABD蛋白明显入核。本课题组前期研究发现,FABD结构域缺失后BCR/ABL蛋白(以BCR/ABL-ΔFABD)不入核,其仍然滞留于胞浆中呈颗粒状分布,其机制尚不明确。因此,本课题拟以无BCR/ABL表达的293T细胞为研究模型,进一步探讨FABD结构域缺失对BCR/ABL蛋白在细胞内定位的影响机制。方法第一部分实验首先用前期构建的野生型腺病毒质粒pAd-Bcr/Abl、缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD转染293T细胞,应用流式细胞术(FCM)检测转染荧光强度并筛选最佳转染条件,Western blot验证蛋白表达。其次,应用激酶活性实验及免疫沉淀(IP)实验检测FABD结构域对BCR/ABL酪氨酸激酶(TK)活性的影响;间接免疫荧光(IF)及激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察BCR/ABL激酶活性对BCR/ABL胞浆定位的影响。第二部分实验用免疫共沉淀(Co-IP)检测BCR/ABL与细胞骨架蛋白F-actin,α-Tubulin的相互作用改变;Co-IP样本经SDS凝胶银染后应用质谱(MS)筛选与BCR/ABL互作的蛋白并进一步验证。IF检测BCR/ABL与细胞骨架蛋白F-actin,α-Tubulin共定位变化。最后,Western blot分别检测磷酸化BCR/ABL(p-Y412)、磷酸化BCR/ABL(p-Y177)及细胞骨架蛋白F-actin、α-Tubulin、FAK、Paxillin的表达。结果前期成功构建了野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒,转染293T细胞48h效率可达51.4%,并呈时间依赖性增加,最终选择48h为最佳转染时间。FABD结构域缺失可显著增加BCR/ABL蛋白磷酸化水平,增强其酪氨酸激酶活性,该效应不受Imatinib抑制。同时磷酸化BCR/ABL(p-Y412)、磷酸化BCR/ABL(p-Y177)蛋白均增加。转染p Ad-Bcr/Abl-ΔFABD并加入核输出抑制剂LMB后,BCR/ABL蛋白并不入核而定位于胞浆中呈颗粒状分布;BCR/ABL蛋白与细胞骨架蛋白F-actin的共定位及相互作用消失;通过质谱鉴定出的另一种细胞骨架蛋白α-Tubulin与BCR/ABL相互作用及共定位也明显减少。此外,其它细胞骨架蛋白如FAK、Paxillin、CRKL、F-actin等表达明显减少。结论FABD结构域缺失后BCR/ABL蛋白定位于胞浆的可能机制:(1)FABD结构域缺失显著升高了BCR/ABL酪蛋白激酶活性,可能是通过增高BCR端Y177位点磷酸化水平所致;升高的TK活性使BCR/ABL融合蛋白滞留在胞浆。(2)FABD结构域缺失引起的BCR/ABL蛋白与细胞骨架蛋白F-actin、α-Tubulin的共定位及相互作用的消失或减少,也使BCR/ABL蛋白滞留于胞浆中呈颗粒状分布。此外,其它多种细胞骨架蛋白表达下调导致的BCR/ABL与F-actin、Paxillin等纤维丝状骨架蛋白直接或间接结合减少也是BCR/ABL蛋白滞留于胞浆的另一原因。