研究背景大肠癌是最常见的致死性恶性肿瘤之一。肿瘤微环境在恶性肿瘤发生、发展及转移中发挥重要作用。免疫细胞是肿瘤微环境的核心组分,研究表明,免疫细胞能通过诱导基因突变、促进肿瘤细胞增殖和存活、促进血管新生及颠覆抗肿瘤免疫应答等多种机制促进肿瘤进展。近年来研究证实大肠癌组织中存在多种免疫细胞浸润,且不同免疫细胞亚群、数量与肿瘤预后的关系截然不同。在肿瘤微环境中,肿瘤及基质细胞通过分泌细胞因子、趋化因子及多种代谢产物招募、诱导Treg细胞(regulatory T cells,调节性T淋巴细胞)、TAM(tumor-associated macrophages,肿瘤相关巨噬细胞)及PMN-MDSCs(Polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells,多分叶核髓系起源的抑制细胞)等免疫抑制性细胞建立免疫抑制网络,来抑制CD8+T淋巴等抗肿瘤效应T细胞和NK细胞(natural killer cells, 自然杀伤细胞)的细胞毒性功能,从而促进肿瘤进展.近年来研究表明,肿瘤组织中浸润性Treg细胞比例增高预示着癌症患者不良预后。因此,解除Treg细胞对效应细胞的免疫抑制状态似乎对肿瘤治疗有希望。目前,daclizumab,ONTAK等靶向Treg细胞的药物已经应用于临床试验中,并且取得了一些较好的效果。然而,在人大肠癌患者中,Treg细胞与预后的关系在临床研究中仍然互相矛盾。到目前为止,靶向Treg细胞的免疫疗法来有效治疗大肠癌的临床试验尚未见报道。这表明当前针对大肠癌浸润性Treg细胞的免疫治疗策略是行不通的,也进一步反映Treg细胞本身很可能不是促进大肠癌进展的关键组分。鉴于Treg细胞是一个异质群体,因此,我们推测,在人大肠癌中,很可能存在另外一种免疫抑制性细胞亚群,在促进肿瘤进展及免疫逃逸中起到关键作用。γ8T细胞因其TCR由γ及δ重链构成而得名,它包含多种功能亚群和组织特异性亚群,并广泛参与免疫应答的调控。γδT细胞广泛分布于肠粘膜组织中,在肠道黏膜的稳态以及免疫调节中具有重要作用,是研究大肠癌免疫微环境的关键切入点。另外,人γδT细胞在不同条件刺激下可极化为多种功能亚群,目前与人肿瘤有关的γδT细胞亚群研究非常有限,文献检索仅有2篇乳腺癌研究中FoxP3+γδT细胞及本课题组研究发现的大肠癌浸润yδT17细胞亚群。然而,大肠癌浸润y8T17细胞的免疫抑制作用是通过募集PMN-MDSC细胞来间接实现的,那么,是否存在具有直接的或更强的免疫抑制功能的γδT细胞亚群需进一步探索。我们的前期研究揭示了人大肠癌中以γδT17为核心的炎症性DC(Inflammatory DCs, infDC)/γδT17/PMN-MDSCs)炎症免疫调控轴,能促进人大肠癌免疫逃逸及进展,提示yδT细胞亚群在人大肠癌免疫调控中的特殊意义。进一步研究发现,肿瘤浸润γδT细胞高表达CD39分子(约50%)。且人CD39~+y8T细胞数量在肿瘤组织显著增多。CD39是一种细胞外核苷酶,为参与腺苷代谢的重要组分。其高表达与一些肿瘤预后差有关,利用CD39抑制剂POM-1处理可显著抑制恶性黑色素瘤皮下移植瘤生长,但仅有小鼠过敏性皮炎的模型研究发现CD39~+γδT细胞具有免疫抑制功能,提示CD39为γδTreg的一个特异性标志物。因此,结合课题组前期研究结果,我们认为,人大肠癌浸润CD39~+γδT细胞很可能是一新型免疫调节细胞亚群。我们对大肠癌浸润CD39~+γδT细胞功能的初步研究显示,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞能显著抑制外周血CD3+T细胞体外增殖,且其抑制能力显著强于肿瘤浸润传统CD4+Treg细胞,表明CD39~+γδT细胞可能在大肠癌浸润抑制性T细胞中占主导地位。另外,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞的免疫抑制功能亦显著强于配对正常组织来源的CD39~+γδT细胞,提示肿瘤微环境能促进CD39~+γδT细胞的免疫抑制功能。然而人CD39~+γδTreg细胞在大肠癌微环境中的地位、诱导极化和发挥免疫抑制功能的机制尚不清楚,我们试图研究CD39~+γδTreg细胞在人大肠癌免疫微环境中的地位、作用及机制,为干预肿瘤免疫抑制和调控免疫逃逸提供理论依据和思路。研究方法1、人大肠癌中CD39~+γδT细胞的鉴定及特征经浙江大学医学院附属第二医院伦理委员会同意及临床确诊大肠癌患者知情同意后,收集2014年1月至2016年1月该院肿瘤外科收治的109例大肠癌手术样本中肿瘤及配对正常肠上皮组织(距离肿瘤边缘>5cm),于体外无菌环境制备单细胞悬液,利用BD FACS Canto Ⅱ多色流式细胞仪检测分析比较人大肠癌和配对正常组织浸润CD39~+γδT细胞的比例、细胞因子分泌谱、分化相关表型、细胞毒相关分子及趋化因子受体表达特征。2、人大肠癌中CD39~+γδT细胞的免疫抑制功能鉴定利用Aria Ⅱ Cell Sorter分选人大肠癌组织及配对正常肠上皮组织中CD39~+γδT细胞；同时分选肿瘤浸润CD39-γδT,传统CD4+Treg细胞,CD39~+CD4+ T及CD39~+CD8+T细胞；分别与免疫磁珠法分离的健康人外周血CD3+T(CFSE染色).CD4+T及CD8+T细胞体外共培养1周,最后利用FCM分别检测不同培养条件下CD3+T细胞增殖,以及ELISA检测CD4+T及CD8+T细胞IFN-γ、granzyme B及perform分泌。3. CD39~+ γδTreg细胞免疫抑制相关机制研究利用E LISA、高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)检测、比较并分析CD39~+γδTreg细胞体外介导CD3+T细胞增殖抑制之研究中各培养体系之间IL-10、腺苷浓度的差异；再利用Aria Ⅱ Cell Sorter分选人大肠癌组织及配对正常肠上皮组织浸润CD39~+γδT细胞；同时分选肿瘤浸润CD39-γδT,传统CD4+Treg, CD39~+CD4+T细胞及CD39~+CD8+T细胞,再分别应用IL-10、TGF-β、CTLA-4及PD-1等中和抗体以及腺苷A2A、A2B受体小分子拮抗剂SCH58261及PSB603,分别与健康人外周血CD3+T (CFSE染色)、CD4+T及CD8+T细胞体外共培养1周,流式检测CD3+T细胞增殖,以及ELISA检测CD4+T及CD8+T细胞IFN-γ及perforin分泌。4、CD39~+γδTreg细胞诱导及机制研究我们首先通过RT-PCR (Real-time PCR)及ELISA对大肠癌及其配对正常肠上皮组织内TGF-β1表达水平进行检测；然后将正常肠上皮组织分选得到的CD39~+γδT细胞与普通培养基或条件培养基(肿瘤组织来源上清、肿瘤组织来源上清+TGF-β1中和抗体)或含有不同浓度人重组TGF-β1的培养基孵育1周,再分别与健康人外周血CFSE染色的CD3+T细胞体外共培养1周,流式检测CD3+ T细胞增殖,并检测、比较分析各培养体系中腺苷浓度的差异。为了研究大肠癌原发灶组织来源的SW480细胞系是否对C D39+γδT细胞具有诱导作用,我们首先利用RT-PCR及ELISA检测SW480细胞TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3表达水平；并利用TGF-β1 siRNA转染SW480细胞下调其TGF-β1的表达。最后,我们将正常肠上皮组织分选得到的C D39+γδT细胞,先分别与不同条件处理过的SW480细胞(SW480细胞+TGF-β1中和抗体；TGF-β1 siRNA转染过的SW480细胞)于体外共培养5天,清洗并收集CD39~+γδT细胞,再分别与健康人外周血CFSE染色的CD3+T细胞体外共培养1周,流式检测CD3+T细胞增殖,并检测、比较分析各培养体系中腺苷浓度的差异。5、肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞与大肠癌临床病理特征的相关性研究最后,为了研究肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞与大肠癌临床病理特征的相关性,我们分析了肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞百分率及数量与TNM分期、肿瘤大小、肿瘤局部浸润、脉管侵犯、淋巴结转移及血液CEA (Carcinoembryonic antigen)浓度的相关性。研究结果1、人大肠癌中,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞占主导地位且表达免疫抑制相关分子。在人大肠癌中,约50%肿瘤浸润γ8T细胞表达CD39分子。人CD39~+γδT细胞数量在肿瘤组织显著增多,并高表达CTLA-4、PD-1及FoxP3等免疫抑制分子,其中CTLA-4、PD-1的表达程度均显著高于CD39~+CD4+T、CD39~+CD8+T细胞。另外,令人惊喜的是,我们发现,在大肠癌组织中,CD39~+γδT细胞在肿瘤浸润性CD3+ T细胞中的绝对数量显著多于传统CD4+Treg细胞。我们对CD39~+γδT细胞的功能研究显示,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞能显著抑制健康人外周血CD3+T细胞的体外增殖,且其抑制能力显著强于肿瘤浸润传统CD4+Treg细胞,提示在人大肠癌中,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞是占主导地位的抑制性T细胞,而不是传统CD4+ Treg细胞。表型上,肿瘤组织浸润CD39~+γδT细胞在表达细胞表面分子如C TLA-4、PD-1、 FoxP3、CD25、CD 161,GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor related gene),趋化因子受体CCR6,PD-L1(PD-1的配体)及细胞毒性受体NKp44,显著高于配对正常组织浸润CD39~+γδT细胞；而免疫效应分子如TRAIL,细胞毒性受体NKp46及共刺激分子CD80则显著降低。肿瘤组织浸润CD39~+γδT细胞以Vδ1型为主。另外,肿瘤组织浸润CD39~+γδT细胞在分泌细胞因子如IL一10,IL-17A, GM-CSF,TGF-β1,TNF-α,S100A9显著多于正常组织浸润CD39~+γδT细胞；而IFN-γ and IL-2分泌则显著减少。接下来,我比较了肿瘤组织浸润CD39~+γδT及CD39-γδT细胞在细胞表型方面的差异。CD39~+γδT细胞表达更高水平FoxP3,CD25,CTLA-4,PD-1,PD-L1, CD161,GITR,NKp44及NKp46.而且,CD39~+γδT较CD39-γδT细胞分泌更多IL-10,IL-17A,GM-CSF,TGF-β1,TNF-α； 而IFN-γ分泌则显著减少。2、人大肠癌中,肿瘤浸润CD39~+γδT细胞较其它调节性T细胞具有更强的免疫抑制功能。体外研究表明,肿瘤组织浸润CD39~+γδT、CD39-γδT、传统CD4+ Treg、CD39~+ CD8+T细胞及配对正常组织浸润CD39~+γδT细胞或多或少都能抑制外周血CD3+T细胞的增殖。然而,肿瘤组织浸润CD39~+γδT细胞的免疫抑制功能显著强于其它免疫抑制性T细胞,包括传统CD4+ Treg细胞。进一步研究显示,肿瘤组织浸润CD39~+γδT细胞能显著抑制外周血CD4+T、CD8+T细胞分泌IIN-γ及perforin、granzyme B,且其抑制能力显著强于其它免疫抑制性T细胞包括肿瘤组织浸润CD39-γδT、CD39~+CD4+ T、CD39~+CD8+T细胞及配对正常组织浸润CD39~+y8T细胞。3、CD39~+γδTreg细胞通过腺苷通路实现免疫抑制功能。首先,我们利用ELISA检测发现,CD39~+γδTreg细胞体外介导外周血CD3+T细胞增殖抑制之共培养体系中IL-10含量都非常低；接下来,体外阻断实验表明,CD39~+γδTreg细胞对外周血CD3+T细胞的增殖抑制作用不能被IL-10或TGF-β的中和抗体所阻断。进一步体外研究表明,CD39~+γδTreg细胞对外周血CD4+T、CD8+T细胞分泌IFN-γ及perforin的抑制作用被CTLA-4或PD-1阻断抗体仅仅是轻微地阻断,这也提示CTLA-4或PD-1不是CD39~+γδTreg细胞发挥免疫抑制效应的关键介导因子。我们发现CD39~+γδT细胞中存在一群共表达CD73的细胞,即CD39~+CD73+γδT细胞。同时,我们利用HPLC检测发现,肿瘤组织来源上清中的腺苷浓度显著高于配对正常组织来源上清；另外,在上述CD39~+γδT细胞介导的外周血CD3+ T细胞增殖抑制之共培养体系中,我们发现,来自肿瘤浸润CD39~+γδT细胞参与的共培养上清中的腺苷浓度显著高于其它细胞参与的共培养上清。接下来,我们发现,CD39~+γδT细胞对外周血CD3+T细胞增殖以及CD4+ T、CD8+T细胞分泌IFN-γ或perforin的抑制效应能完全被腺苷A2A、A2B受体的小分子拮抗剂S CH58261及PSB603所阻断,由此证明,CD39~+γδTreg细胞的免疫抑制作用是通过腺苷通路实现。4、肿瘤来源的TGF-β1能诱导CD39~+γδT细胞产生大量腺苷首先,我们通过RT-PCR及ELIS A检测发现,TGF-β1在肿瘤组织中的含量显著高于其配对正常组织；接下来我们发现,正常组织来源的CD39~+γδT细胞经肿瘤组织上清培养1周后,其产生腺苷能力及免疫抑制功能均显著增强；而加入TGF-β1中和抗体后,其免疫抑制功能则无明显增强。进一步研究发现,人重组TGF-β1色诱导正常组织来源CD39~+ γδT细胞产生更多腺苷,且TGF-β1的这一诱导作用呈浓度依赖性。最后,我们发现SW480细胞显著高表达TGF-β1,而非TGF-β2或TGF-β3。同时,利用TGF-β1 siRNA转染SW480细胞来下调TGF-β1在SW480细胞中的表达水平。进一步研究发现,SW480细胞使正常组织来源CD39~+γδT细胞免疫抑制功能及产生腺苷能力均显著增强,而加入TGF-β1中和抗体或经TGF-β1 siRNA转染处理则让SW480细胞的诱导能力显著降低,表明SW480细胞对正常组织来源CD39~+γδTT细胞的诱导作用是通过TGF-β1实现的。5、肿瘤浸润C D39+γδTreg细胞与大肠癌恶性临床病理学特征呈正相关通过对大肠癌浸润CD39~+γδTreg细胞数量与病人临床分期的相关分析,我们发现肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞百分率及数量与TNM分期、肿瘤大小、肿瘤局部浸润、脉管侵犯、淋巴结转移及血清CEA水平呈正相关。结论我们的研究首次揭示了人大肠癌中新型肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞是占主导地位的抑制性T细胞以及肿瘤免疫抑制微环境的形成和免疫逃逸的关键介导者,提示CD39~+γδTreg细胞浸润可能是人大肠癌的一个预后差的指标。因此,靶向CD39~+γδTreg细胞为有效治疗大肠癌提供了潜在的可能性。创新点1、首次证明,在人大肠癌中,新型肿瘤浸润CD39~+γδTreg细胞是占主导地位及具有强免疫抑制功能的抑制性T细胞,而非传统观念认为的传统CD4+Treg细胞；2、首次揭示了人大肠癌微环境中,“肿瘤细胞TGF-β1-CD39~+γδTreg细胞极化-腺苷-免疫抑制-肿瘤进展”肿瘤调控新机制；3、首次表明CD39~+y8Treg细胞浸润可能是人大肠癌的一个预后差的指标。