研究背景脑卒中是影响人类健康的重大疾病之一,具有高发病率、高致死率、高致残率等特点。在我国,缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)占据脑卒中发生的70%左右。IS的临床治疗策略以血管再通和神经保护为主,由于治疗时间窗狭窄及病程复杂,目前的治疗方法虽各有优势但仍存在不足之处,因此多样化的治疗策略对于复杂的临床需求是必要且迫切的。研究发现新生血管密度与IS预后转归呈正相关性,表明血管新生在IS治疗中起着重要作用。通过血管新生和血管重塑可增加损伤部位供血,改善缺血缺氧损伤。血流恢复、血运重建贯穿于IS急性、亚急性期及慢性恢复期整个过程。在IS急性期血管新生的过程及新生的血管可减轻缺血半暗带损伤,在IS亚急性期及恢复期则可促进神经功能恢复。因此,血管新生、血运重建是IS治疗的关键所在。生松素(Pinocembrin,PCB)是天然二氢黄酮类化合物,对IS有良好的治疗作用。通过体内、外多靶点的筛选研究发现PCB具有良好的扩张血管、改善脑血流及很强的神经细胞保护作用。其对实验性脑缺血引起的脑组织损伤具有良好的保护作用,可缩小脑组织梗死体积,改善脑缺血动物行为学障碍,促进脑缺血动物的脑功能恢复,对脑缺血后血管系统与神经组织之间的损伤级联反应具有广泛的抑制作用。PCB已被CFDA批准为治疗脑缺血1.1类新药,目前正在Ⅱ期临床试验当中。虽然已有研究发现PCB对脑血管系统具有积极作用,但是对于PCB是否具有促血管新生作用,尚无明确研究结论。研究目的基于上述研究背景,本课题以IS为研究对象,建立体内外模型探讨PCB是否具有促血管新生作用并探索其可能的作用机制。研究方法首先采用MTT实验、划痕实验、小管形成实验、缺氧缺糖再复氧复糖(Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)模型评价 PCB 对人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells,hBMECs)增殖、迁移、小管形成和抗缺氧缺糖能力影响,考察其在体外是否具有血管新生作用,而后采用经典的鸡胚绒毛尿囊膜模型考察PCB在体内是否具有促血管新生作用,进而采用大鼠中动脉栓塞模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)评价PCB对大鼠神经行为学评分、缺血半暗带内微血管密度、脑微血流影响,以此来考察其是否在疾病模型上具有促血管新生作用,最后通过Western Blot技术测定PCB对血管生长相关因子表达的影响,以期探索其可能的作用机制。研究结果1.生松素具有体外促血管新生作用MTT实验结果显示PCB 5-150 μM作用24、48 h均可显著促进hBMECs增殖,具有一定剂量和时间依赖性。划痕实验结果显示PCB 5-80 μM作用24 h均可显著促进hBMECs迁移,促迁移率约在40-50%,且具有一定剂量依赖性,各浓度作用效果与阳性药(bFGF 20 μg/mL)相当。小管形成实验中PCB 80 μM组小管分支数量和小管分支总长度分别为202±37、12239±2425显著高于对照组(130±23、8048±2000),可显著增加小管分支数量和分支长度,表明PCB可促进小管形成。利用OGD/R模型模拟缺血再灌注过程,结果显示在hBMECs糖氧剥夺2 h后PCB干预12h可显著提高细胞存活率,且存在一定剂量依赖性,PCB80 μM作用效果与阳性药(bFGF 20 μg/mL)相当。以上结果共同表明PCB 5-80μM可显著提高hBMECs增殖、迁移、小管形成能力,增强hBMECs抗缺氧缺糖能力,具有体外促进血管新生作用。2.生松素可促进鸡胚绒毛尿囊膜上血管新生采用鸡胚绒毛尿囊膜模型考察PCB是否在体内具有促血管新生作用。选用6日龄鸡胚进行开窗给药,PCB 50、100 μM干预3d均可显著增加鸡胚绒毛尿囊膜上血管数量,促进血管分支,其对小血管新生促进作用较强,且具有一定剂量依赖性。PCB 50、100μM促进小血管新生作用与阳性药(bFGF 50μg/mL)相当。以上结果表明PCB可在体内促进血管新生。3.生松素可促进急性脑缺血再灌注大鼠脑组织血管新生采用线栓法制备大鼠MCAO模型,缺血1.5 h后,拔出线栓进行再灌注。术后2h,给药组大鼠尾静脉注射PCB(5 mg/kg),模型组和假手术组大鼠给予等体积生理盐水,每日一次直至取样。在术后3、7、14 d采用Zea-Longa’s评分法进行大鼠神经行为学评分,结果显示PCB可显著降低术后3、7、14 d大鼠神经行为学评分,且具有一定的时间依赖性,可促进大鼠神经系统恢复。在术后7d采用TTC染色法测定大鼠脑梗死体积百分比,结果显示PCB干预7d可显著降低大鼠脑梗死体积百分比,且可增加大鼠体重,促进大鼠机能恢复。在术后3、7、14d利用免疫荧光染色技术测定大鼠缺血半暗带内微血管密度,结果显示PCB干预7、14 d可显著促进大鼠缺血半暗带内微血管新生与成熟,增加微血管密度,挽救缺血半暗带功能,且存在一定时间依赖性。在术前、术后即刻、术后3、7、14d利用激光多普勒血流仪测定大鼠脑微血流变化,结果显示PCB干预7、14 d可显著增加脑梗死区域脑血流量。以上结果表明PCB可促进MCAO大鼠脑组织血管新生,恢复脑梗死区域血流供应。4.生松素可能通过激活HIF-1α/Ang-1/Tie-2和HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号轴发挥促脑血管新生作用采用Western Blot技术测定PCB对细胞及大鼠脑组织皮层血管新生相关蛋白表达影响。在细胞实验中,结果显示PCB40、80μM干预12h可显著上调Ang-1、Tie-2蛋白表达。在动物实验中,PCB干预3d可显著上调Ang-1蛋白表达,表明PCB在干预早期即可上调部分血管新生相关蛋白表达。PCB干预7 d、14 d均可显著上调VEGFR2、Tie-2、Ang-1蛋白表达,且上调上游调控因子缺氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)表达,表明在脑卒中亚急性期和慢性恢复期PCB仍对血管新生相关蛋白表达产生影响。PCB可能可通过激活HIF-1α/Ang-1/Tie-2和HIF-1α/VEGFA/VEGFR2信号轴发挥促血管新生作用。研究结论综上,PCB在体内外均具有促血管新生作用,可促进hBMECs增殖、迁移、小管形成,提高糖氧剥夺损伤后内皮细胞存活率,促进鸡胚绒毛尿囊膜上血管新生。在大鼠 MCAO 模型中 PCB 可通过 HIF-1α 上调 VEGFA、VEGFR2、Ang-1、Tie-2 蛋白表达,进而激活下游多条信号通路,促进血管新生,从而增加MCAO大鼠缺血半暗带内微血管密度,恢复脑梗死区域血流供应,减少脑梗死体积。本课题系统地证实了 PCB在体内体外均具有促血管新生作用,且初步探索了其作用机制,以期为PCB临床试验提供更多理论基础和科学依据。