背景:细胞外间质(extracellular matrix,ECM)沉积是肝纤维化最本质的病理特征,胶原是ECM的主要成分。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)能够调节转录调节因子Smad3的乙酰化水平,影响胶原的转录,促进肝纤维化的发生发展。新近研究发现,沉默信息调节因子1(Sirtuinl,SIRT1)能够去乙酰化Smad3,影响Smad3的转录活性。本实验组首次报道鼠尾草酸(Carnosic acid,CA)对SIRT1的调节作用,但是鼠尾草酸调控SIRT1对大鼠肝纤维化损伤的影响,尚未见报道。目的:探讨鼠尾草酸对肝纤维化损伤的保护作用及其相关分子机制。首次研究SIRT1对Smad3的去乙酰化在肝纤维化损伤中的作用,揭示肝纤维化损伤疾病发展的机制,提供新的治疗靶点。方法:1.鼠尾草酸对DMN诱导的肝纤维化损伤保护作用的研究30只SD(Sprague Dawley)大鼠,雄性,SPF级,体重180～220g,随机分为五组:(A)正常对照组、(B)鼠尾草酸正常给药组(60mg/kg)、(C)二甲基亚硝胺(dimethylamine,DMN)组、(D)DMN+鼠尾草酸(30mg/kg)给药组、(E)DMN+鼠尾草酸(60mg/kg)给药组。C、D、E组腹腔注射DMN8mg/kg/day,每周连续给药三天,给药四周,A、B组腹腔注射等量生理盐水。D组灌胃给予鼠尾草酸混悬液(30mg/kg/day),B、E组灌胃给予鼠尾草酸混悬液60mg/kg/day,给药六周,A、C组灌胃等量的溶媒橄榄油。六周后腹主动脉采集血液,留取肝脏组织标本。检测血清中谷丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,ALT)、谷草氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST)、透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、Ⅲ型前胶原(procollagen-3-peptide,PCⅢ)的活性。采用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)检查肝脏病理改变。采用Masson染色检测肝脏组织胶原的累积与分布。采用 Western blotting 法检测肝组织 SIRT1、Smad3、acety1-Smad3、AMP 依赖的蛋白激酶-α1(Adenosine 5’-monophosphate AMP-activated protein kinaseα1,AMPKα1)、磷酸化 AMP 依赖的蛋白激酶-α1(phosphorylation-AMPK α1,pAMPKα1)、α2(Ⅰ)collagen(COL1A2)、α 平滑肌肌动蛋白(Smooth muscle actin-α,α-SMA)蛋白水平。Real-timePCR法检测肝组织COL1A2mRNA水平。2.鼠尾草酸对TGF-β1诱导的HSC-T6或LX-2细胞损伤的保护作用及相关机制研究(1)鼠尾草酸对TGF-β1诱导的HSC-T6细胞损伤的保护作用HSC-T6细胞分组:(A)空白对照组;低、中、高浓度鼠尾草酸给药组2.5 μM、5 μM、10 μM)。(B)空白对照组;TGF-β1组;低、中、高浓度鼠尾草酸预处理组(2.5 μM、5 μM、10 μM)。不同浓度的鼠尾草酸与细胞共同孵育6 h后,TGF-β1(2ng/ml)诱导24h,建立体外肝纤维化损伤模型。MTT比色法检测细胞生存率。(2)鼠尾草酸对HSC-T6和LX-2细胞中SIRT1的诱导作用HSC-T6细胞分组:空白对照组;低、中、高浓度鼠尾草酸给药组(2.5 μM、5 μM、10 μM)。不同浓度的鼠尾草酸与细胞共同孵育6h后,提取细胞蛋白。Western blotting法检测细胞SIRT1蛋白表达水平。(3)鼠尾草酸上调SIRT1对COL1A2转录和蛋白表达的影响HSC-T6和LX-2细胞随机分为四组:阴性对照组(si-control)、阴性对照(si-control)+ 鼠尾草酸给药组、转染 SIRT1 small interfering RNA(siRNA)组、转染SIRT1 si-RNA+鼠尾草酸给药组。SIRT1 siRNA序列转染细胞后,鼠尾草酸(10μM)与细胞共同孵育6h后,提取细胞蛋白。Westernblotting法检测COL1A2蛋白表达水平,real-time PCR法检测COL1A2 mRNA表达水平。(4)鼠尾草酸上调SIRT1对Smad3乙酰化水平的调节作用HSC-T6和LX-2细胞随机分为四组:阴性对照组(si-control)、阴性对照(si-control)+鼠尾草酸给药组、转染SIRT1 siRNA组、转染SIRT1 siRNA+鼠尾草酸给药组。SIRT1siRNA序列转染细胞后,鼠尾草酸(10μM)与细胞共同孵育6 h后,提取细胞蛋白。Western blotting法检测细胞内Smad3蛋白表达水平,免疫沉淀法检测乙酰化Smad3蛋白表达水平。(5)SIRT1/Smad3信号通路对TGF-β1诱导的细胞损伤的保护作用HSC-T6细胞分组(A)SIRT1过表达实验分组:空白对照组、鼠尾草酸给药组、TGF-β1组、TGF-β1+鼠尾草酸预处理组、TGF-β1+白藜芦醇(Resveratrol,Res)预处理组。(B)SIRT1低表达实验分组:空白对照组、鼠尾草酸正常给药组、TGF-β1组、TGF-β1 +鼠尾草酸预处理组、TGF-β1+EX527组、TGF-β1+ EX527+鼠尾草酸预处理组。鼠尾草酸(10μM)、Res(10μM)或EX527(10μM)与细胞共同孵育6h 后,TGF-β1(2ng/ml)诱导 24h,Western blotting 检测 SIRT1、COL1A2 蛋白表达水平。(6)SIRT1对Smad3转录活性的影响LX-2细胞分组:空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+鼠尾草酸预处理组、TGF-β1 +EX527组、TGF-β1+ EX527+鼠尾草酸预处理组。分别转染pGL4.48[luc2P/SBE/Hygro]Vector质粒载体和空白对照pRL-TK Vetor质粒载体,待细胞汇合率达80%,鼠尾草酸(10μM)、EX527(10μM)与细胞共同孵育6h后,TGF-β1(2ng/ml)诱导造模24h,双荧光素酶报告基因法测试Smad3的转录活性。(7)鼠尾草酸调节AMPKα1对SIRT1的作用LX-2细胞分组(A)AMPKα1干扰实验:阴性对照组(si-control)、阴性对照(si-control)+ 鼠尾草酸给药组、转染 AMPKα1 siRNA 组、转染 AMPKα1 siRNA+鼠尾草酸给药组。转染后,鼠尾草酸(10μM)与细胞共同孵育6 h后,提取细胞蛋白。Western blotting法检测 AMPKα1、pAMPKα1、SIRT1 蛋白水平。(B)LX-2细胞损伤实验分组:空白对照组、鼠尾草酸给药组、TGF-ββ1组、TGF-β1 +鼠尾草酸预处理组。鼠尾草酸(10μM)与细胞共同孵育6h后,TGF-β1(2ng/ml)诱导24 h,Western blotting 法检测细胞内 pAMPKα1、AMPKα1、SIRT1、COL1A2 蛋白表达水平。结果:实验结果表明:DMN诱导的大鼠肝纤维化损伤,会引起肝细胞损伤指标ALT、AST活性增加,肝纤维化指标HA、PCⅢ含量明显上升,大鼠肝脏组织COL1A2 mRNA表达、COL1A2和α-SMA蛋白水平显著上升。而同时给予鼠尾草酸处理,上述现象明显改善。更重要的是,鼠尾草酸显著上调了 SIRT1的蛋白表达水平,降低了乙酰化Smad3的蛋白表达水平。细胞实验结果显示,在一定的浓度范围内,鼠尾草酸对SIRT1蛋白表达的上调作用呈现浓度依赖性。体外干扰SIRT1内源性表达,药物对SIRT1蛋白表达的上调作用及乙酰化Smad3蛋白表达的抑制作用消失。双荧光素酶报告基因实验结果显示鼠尾草酸主要通过调节SIRT1蛋白的表达,发挥其去乙酰化作用,进而影响Smad3的转录活性。进一步探讨鼠尾草酸对SIRT1的调节机制发现,鼠尾草酸通过影响AMPKα1的磷酸化水平,调节SIRT1的蛋白表达。以上结果表明,鼠尾草酸通过调控AMPKα1/SIRT1信号通路,调节Smad3的乙酰化水平从而抑制COL1A2的转录,对抗肝纤维化损伤。结论:1.鼠尾草酸对肝纤维化损伤具有保护作用。2.在肝纤维化损伤中,SIRT1通过调控Smad3的乙酰化水平从而抑制COL1A2的转录。3.鼠尾草酸通过调节AMPKα1/SIRT1通路对抗肝纤维化损伤。