核酸酶通过内切核酸酶机制水解核酸骨架中的磷酸二酯键。核酸酶在DNA的复制、重组、修复、基因鉴定、基因定位和分子克隆等细胞过程中发挥着重要作用。目前,检测核酸酶活性的方法包括凝胶电泳法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附测定法、基于分子信标的荧光分析法、表面等离子共振技术、比色法,然而这些分析方法通常耗时费力,涉及放射性物质和复合纳米颗粒的复杂合成,并且其中的一些方法无法区分多个目标物。因此,亟需发展一种用于多种核酸酶检测的新方法。DNA自组装形成的纳米结构是具有良好可控理化性质的静态结构,也是能在外部刺激下进行重新配置的动态结构。一系列的多维纳米结构被构建出来,应用于生物计算、生物传感、生化催化、纳米机器、药物运输以及等离子体设备等领域。在特定的沃森-克里克碱基对杂交的基础上,荧光染料和纳米颗粒可以固定在DNA纳米结构上的预定位置,实现基于荧光共振能量转移(FRET)的光学检测。这种基于DNA的荧光共振能量转移在纳米结构分析、生物传感、诊断治疗等领域得到了广泛应用。由于DNA四面体纳米结构具有明确的三维结构和方便的纳米组装的特性,它被认为是功能化纳米元器件组装的优良DNA框架。我们发展了一种新的四色荧光探针。该探针基于FRET与DNA四面体纳米结构的整合,用于比率检测多种核酸酶。四条长度为53mer的DNA单链,经过简单的退火反应即可形成DNA四面体纳米结构。该荧光探针由分别标记有二乙氨基香豆素(DEA)、羧基荧光素(FAM)、Texas Red和Cy5荧光团的DNA构建。经过设计,完整的四色荧光探针上可以发生多步FRET过程:DEA作为供体,FAM和Texas Red作为受体/供体,Cy5作为受体,当DEA被激发光激发时,能量通过FAM和Texas Red可以传递到Cy5上,导致了DEA、FAM、Texas Red和Cy5的荧光发射。我们在探针上设计了三种核酸酶XhoI、HindIII和KpnI的切割位点。当目标核酸酶存在时,特定位点被切割,导致荧光分子荧光强度发生变化,据此实现比率检测多种核酸酶。该探针由DNA四面体纳米结构及其连接的四种荧光染料组成,涉及多步FRET过程。这种四色荧光探针在单一波长激发的条件下可以同时产生四种荧光发射信号,可以准确区分包括KpnI、HindIII和XhoI多种核酸酶。与常规的只有一对供体/受体的FRET探针检测多种核酸酶的过程相比,这种四色荧光探针具有更加简便的优势。另外,这种四色荧光探针对于目标物酶具有良好的选择性,还可以被用来筛选核酸酶的抑制剂。这种四色荧光探针还可以通过结构修饰使其具有其它多种核酸酶和核糖核酸酶的切割位点,在化学生物学、生物医学研究和临床诊断领域具有潜在应用价值。