研究背景和目的糖尿病肾病是导致慢性肾功能衰竭的主要病因，也是糖尿病患者最严重的并发症之一。糖尿病肾病起因于高血糖，它以基质积聚过多导致的系膜扩张和肾小球基底膜增厚为特点，并伴随进行性的肾功能恶化。肾小管上皮细胞的凋亡是糖尿病肾病的一个中心环节，这在糖尿病动物和病人中被证实。许多转基因小鼠的实验研究表明胰岛素信号传导通路中断可以导致胰岛素作用和β细胞功能产生缺陷，但导致这些缺陷的确切的分子机制还没有被完全阐明。然而,胰岛素信号级联反应和下游信号成分是治疗糖尿病及其相关并发症的最具吸引力的靶点。细胞色素P450表氧化酶代谢花生四烯酸(arachidonic acid, AA)生成四种环氧-二十碳三烯酸(5,6-,8,9-,11,12-, and14,15-EET)，在心血管系统的稳态中，它们发挥许多重要的生物学作用。研究表明环氧-二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs)主要经可溶性表氧化物水解酶(Soluble epoxide hydrolase, sEH)水解成较弱生物学作用的二羟基-20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET)。当抑制可溶性表氧化物水解酶活性时，EETs水解成DHETs的量减少进而导致体内EETs水平增加。sEH抑制剂在肾损伤的动物模型的保护作用已被证实。sEH的抑制剂CDU显著减轻血管紧张素诱导的肾血管和肾小球损伤；sEH抑制剂AUDA降低血压，增加了尿EET/DHET的比率，降低盐敏感高血压大鼠肾脏组织中巨噬细胞的浸润。此外，AUDA延缓与高血压和II型糖尿病相关的肾脏损害的进展。与sEH抑制剂研究类似，sEH基因缺陷小鼠的实验结果表明EETs在肾脏和心血管系统有保护作用。在醋酸去氧皮质酮加高盐诱导的高血压模型中，sEH基因缺陷降低血压，减轻炎症反应，减少肾小球损伤。许多非血管动物模型显示EETs在延缓糖尿病症状进展中发挥重要作用。sEH基因抑制或敲除逆转链脲佐菌素诱导的高血糖，保护胰岛细胞。我们先前的研究发现CYP2J3过表达减轻糖尿病症状，逆转了糖尿病鼠的胰岛素抵抗。EETs通过活化ERK1/2和PI3K/Akt的信号转导通路刺激内皮细胞的生长和血管生成。CYP表氧化酶过表达抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡，其机制可能是激活PI3K/Akt信号转导通路和上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。在本实验研究中，我们设想敲除sEH基因使EETs的降解减少，进而导致体内EETs的水平增加，从而在改善糖尿病肾病的病理改变，减轻肾脏细胞凋亡，延缓糖尿病肾病的进展中发挥重要的保护作用。因此，在STZ诱导的小鼠糖尿病肾病模型中，探讨sEH基因敲除对糖尿病肾病的作用和可能的分子机制，并在体外研究sEH基因沉默和外源性的EETs对HK-2细胞抗损伤的作用和可能的分子机制，在整体水平和离体水平研究CYP表氧化酶-EETs-sEH系统是否能够改善糖尿病肾病的病理改变以及减轻肾脏细胞凋亡，进一步探讨CYP表氧化酶-EETs-sEH系统能否延缓糖尿病肾病的进展。一、体内实验sEH基因敲除改善STZ诱导的小鼠糖尿病肾病的作用及其机制实验目的：探讨sEH基因敲除改善STZ诱导的小鼠糖尿病肾病的作用及其机制的影响及可能的分子机制。实验方法：1．糖尿病肾病小鼠模型的建立：8周龄雄性sEH基因敲除小鼠(Zeldin教授惠赠)与正常野生型C57BL/6小鼠各随机分为4组：正常野生型C57BL/6小鼠组10只；sEH基因敲除小鼠组10只；野生型糖尿病小鼠组20只; sEH基因敲除糖尿病小鼠20只。夜间禁食后，给予野生型糖尿病小鼠组和sEH基因敲除糖尿病小鼠组连续5天腹腔注射50mg/kg体重STZ(用0.l mol/L无菌、pH4.4柠檬酸缓冲液配制，经0.2μm微孔滤膜过滤灭菌);给予正常野生型C57BL/6小鼠组和sEH基因敲除小鼠组连续5天腹腔注射相应体积0.05mol/L无菌柠檬酸缓冲液。STZ注射1周后，通过尾静脉留取血标本并检测血糖水平，血糖大于250mg/dL的小鼠被认为符合糖尿病模型的建立。从糖尿病的C57BL/6小鼠和sEH基因敲除小鼠中随机各挑选10只继续进行实验研究。实验动物所有的操作程序符合中国科学院实验动物管理规范标准，以及NIH实验动物使用与管理指南；2.各组动物继续喂养24周后，测量各组小鼠体重；留取24小时尿标本，加入防腐剂二甲胺，将尿液3,000rpm离心15min后收集其上清，放置于-80℃低温冰箱备用。采用戊巴比妥麻醉并处死动物，内眦静脉采血留取血液标本，3,000rpm离心15min收集小鼠血清，分装后保存于-80℃冰箱备用；测量各组小鼠的肾脏重量；留取肾脏和心脏于液氮冷冻后迅速放入-80℃冰箱备用，同时留取肾脏和心脏组织标本在甲醛溶液固定后，再置于脱水机脱水浸蜡，应用石蜡包埋组织后放置室温备用。3.检测各组小鼠血清中葡萄糖，糖化血红蛋白，肌酐和尿素氮的水平；4.采用ELISA的方法检测各组小鼠尿中的14,15-DHET含量和24h尿蛋白排泄量；5.采用PAS，Masson和TUNEL染色方法评估各组小鼠肾脏形态学改变；6.检测肾脏组织中的Caspase-3活性水平；7.采用Western blot的方法检测各组小鼠肾脏中sEH，cleaved Caspase-3，Bcl-2，Bcl-xl，Bax，PI3K，p-AKT，p-NOS3Ser1177， p-eNOS Thr495及p-AMPK Thr172的表达水平。实验结果：1. Western blot结果显示，sEH基因敲除小鼠组和sEH基因敲除糖尿病小鼠组肾脏无sEH蛋白表达，正常野生型C57BL/6小鼠组和野生型糖尿病小鼠组肾脏sEH蛋白表达丰富，sEH基因在小鼠体内被成功敲除；ELISA检测结果显示，sEH基因敲除小鼠组尿中14,15-DHET的含量为(1.11±0.1) ng/ml明显低于正常野生型C57BL/6小鼠组的(6.62±0.49) ng/ml(P<0.05)；sEH基因敲除糖尿病小鼠组尿中14,15-DHET的含量为(0.92±0.08) ng/ml明显低于野生型糖尿病小鼠组的(6.44±0.4) ng/ml(P<0.05)。2.正常野生型C57BL/6小鼠组的体重(31.2±0.6)g与sEH基因敲除小鼠组的体重(31.1±0.7)g无明显差异(P>0.05)，野生型糖尿病小鼠组的体重(23.8±0.6)g及sEH基因敲除糖尿病小鼠组体重的体重(24.1±0.7)g明显低于正常野生型C57BL/6小鼠组(P<0.05)，但是野生型糖尿病小鼠组和sEH基因敲除糖尿病小鼠组体重无明显差异(P>0.05)。3.正常野生型C57BL/6小鼠组的肾脏指数，血糖，血糖化血红蛋白，血肌酐，血尿素氮及24h尿蛋白排泄量与sEH基因敲除小鼠组无明显差异(P>0.05)，STZ注射25周后，野生型糖尿病小鼠血糖，血糖化血红蛋白，血肌酐，血尿素氮水平及24h尿蛋白排泄量显著升高(P<0.05)，但这些升高的指标在sEH基因敲除糖尿病小鼠组被显著降低(P<0.05)。4. PAS染色结果显示sEH基因敲除显著降低糖尿病诱导的肾脏糖原沉积(P<0.05)；Masson染色结果显示sEH基因敲除显著降低糖尿病诱导的肾脏胶原沉积(P<0.05)；TUNEL染色结果显示sEH基因敲除显著降低糖尿病诱导的肾脏细胞凋亡(P<0.05)。5．sEH基因敲除显著抑制糖尿病诱导的肾脏Caspase-3活性的增加(P<0.05)；Western blot结果显示sEH基因敲除显著降低糖尿病小鼠肾脏cleaved Caspase-3表达水平的上调(P<0.05)。6. Western blot结果显示，正常野生型C57BL/6组和sEH基因敲除小鼠组肾脏中Bcl-2，Bcl-xl，Bax，PI3K，p-AKT，p-NOS3Ser1177，p-eNOS Thr495及p-AMPK Thr172的表达水平相差不大(P>0.05)；与正常野生型C57BL/6组相比，野生型糖尿病小鼠组肾脏组织中的Bcl-2，Bcl-xl，PI3K，p-AKT，p-NOS3Ser1177和p-AMPK Thr172表达水平显著降低(P<0.05)，Bax和p-eNOS Thr495表达水平显著升高(P<0.05)；sEH基因敲除显著抑制糖尿病诱导的肾脏Bcl-2，Bcl-xl，PI3K，p-AKT，p-NOS3Ser1177和p-AMPKThr172表达水平的降低，以及Bax和p-eNOS Thr495表达水平的升高(P<0.05)。二、体外实验sEH基因沉默抑制TNF-α诱导的人肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制实验目的：探讨sEH基因沉默对TNF-α诱导的HK-2细胞凋亡的影响及可能的分子机制。实验方法：1. HK-2细胞培养于含10%FBS的DMEM/F12的培养基，将HK-2细胞置于含5%CO2，37℃的细胞培养箱培养。HK-2细胞培养于75cm2培养瓶生长到90%汇合后用0.25%胰蛋白酶消化传代，当细胞生长到60%-70%汇合时转染siRNA-control或siRNA-sEH；2. siRNA转染24h后，换成含0.5%胎牛血清的DMEM/F12培养基将HK-2细胞饥饿培养12h，然后换用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基，然后进行相应的药物干预处理；3.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，采用流式细胞仪检测sEH基因沉默对HK-2细胞凋亡情况的影响；4.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，检测sEH基因沉默对HK-2细胞Caspase-3活性的影响；5.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，收集HK-2细胞并提取细胞蛋白质，采用Western blot方法检测HK-2细胞中的Bcl-2，Bcl-xL及Bax的表达水平。实验结果：1. sEH基因沉默显著抑制了TNF-α诱导的HK-2细胞的凋亡。结果显示，sEH基因沉默使HK-2凋亡细胞的比例明显减少,未干预的对照组HK-2凋亡细胞的比例为(4.6±0.6)%；TNF-α处理组HK-2凋亡细胞的比例为(33.5±2.7)%；TNF-α+siRNA-control组和TNF-α+siRNA-sEH组HK-2凋亡细胞的比例分别为(34.6±2.6)%和(12.5±1.2)%。TNF-α+siRNA-sEH组凋亡细胞的比例和TNF-α处理组的差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。2. sEH基因沉默显著抑制了TNF-α诱导的HK-2细胞Caspase-3的活化。结果显示，与未干预的对照组相比，TNF-α处理组HK-2细胞的Caspase-3活性显著升高(P<0.05)；与TNF-α处理组相比，TNF-α+siRNA-sEH组HK-2细胞的Caspase-3活性显著降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。3. Western blot检测的结果显示，TNF-α显著降低了HK-2细胞Bcl-2及Bcl-xL的表达水平，增加了HK-2细胞Bax的表达水平(P<0.05)；但是，sEH基因沉默显著抑制了TNF-α诱导的Bcl-2，Bcl-xL的表达水平的下降及Bax的表达水平增加(P<0.05)。三、体外实验外源性EETs抑制TNF-α诱导的人肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制实验目的：探讨外源性EETs对TNF-α诱导的HK-2细胞凋亡的影响及可能的分子机制。实验方法：1. HK-2细胞培养于含10%FBS的DMEM/F12的培养基，将HK-2细胞置于含5%CO2，37℃的细胞培养箱培养。HK-2细胞培养于75cm2培养瓶生长到90%汇合后用0.25%胰蛋白酶消化传代，对细胞进行同步化处理，即当细胞生长到70%-80%汇合时，换成含0.5%胎牛血清的DMEM/F12培养基将HK-2细胞饥饿培养12h，然后换用不含胎牛血清的DMEM/F12培养基，然后进行相应的药物干预处理；2.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，采用流式细胞仪检测EETs对HK-2细胞凋亡情况的影响；3.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，将AKT，PI3K，MAPK及MEK抑制剂AKTI, LY294002，Apigenin及PD98059，与HK-2细胞以及14,15-EET共同孵育24h，采用流式细胞仪检测EETs对HK-2细胞凋亡情况的影响；4.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，检测EETs对HK-2细胞Caspase-3活性的影响；5.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，将AKT，PI3K，MAPK及MEK抑制剂AKTI, LY294002，Apigenin及PD98059，与HK-2细胞以及14,15-EET共同孵育24h，检测EETs对HK-2细胞Caspase-3活性的影响；6.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，EETs与HK-2细胞共同孵育24h，收集HK-2细胞并提取细胞蛋白质，采用Western blot方法检测HK-2细胞中的Bcl-2，PI3K, P-AKT与P-Erk1/2的表达；7.经过同步化处理的HK-2细胞，应用TNF-α/actinomycin D诱导细胞凋亡，将AKT，PI3K，MAPK及MEK抑制剂AKTI, LY294002，Apigenin及PD98059，与HK-2细胞以及14,15-EET共同孵育24h，收集HK-2细胞并提取细胞蛋白质，采用Westernblot方法检测HK-2细胞中Bcl-2的表达。实验结果：1.8,9-EET，11,12-EET与14,15-EET显著抑制了TNF-α诱导的HK-2细胞的凋亡。结果显示，EETs使HK-2凋亡细胞的比例明显减少,未干预的对照组HK-2凋亡细胞的比例为(4.5±0.6)%；TNF-α处理组HK-2凋亡细胞的比例为(31.1±1.9)%；TNF-α+8,9-EET组，TNF-α+11,12-EET组和TNF-α+14,15-EET组HK-2凋亡细胞的比例为(14.1±1.2)%，(12.1±1.1)%和(8.8±1.0)%。TNF-α+8,9-EET组，TNF-α+11,12-EET组和TNF-α+14,15-EET组凋亡细胞的比例和TNF-α处理组的差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。2. AKT抑制剂AKTI，PI3K抑制剂LY294002，MAPK抑制剂Apigenin及MEK抑制剂PD98059明显逆转了14,15-EET抑制TNF-α诱导的HK-2细胞凋亡的作用。结果显示，未干预的对照组HK-2凋亡细胞的比例为(4.6±0.5)%；TNF-α处理组HK-2凋亡细胞的比例为(26.5±2.1)%；TNF-α+14,15-EET组HK-2凋亡细胞的比例为(8.5±0.7)%； TNF-α+14,15-EET+AKTI组， TNF-α+14,15-EET+LY294002组，TNF-α+14,15-EET+Apigenin组和TNF-α+14,15-EET+PD98059组HK-2凋亡细胞的比例分别为(19.5±1.2)%，(19.9±1.3)%，(21.0±1.4)%和(22.6±1.5)%。TNF-α+14,15-EET+AKTI组， TNF-α+14,15-EET+LY294002组，TNF-α+14,15-EET+Apigenin组和TNF-α+14,15-EET+PD98059组的凋亡细胞比例和TNF-α+14,15-EET组的差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。3.8,9-EET，11,12-EET与14,15-EET显著抑制了TNF-α诱导的HK-2细胞caspase-3的活化。结果显示，与未干预的对照组相比，TNF-α处理组HK-2细胞的caspase-3活性显著升高(P<0.05)；与TNF-α处理组相比，TNF-α+8,9-EET组，TNF-α+11,12-EET组和TNF-α+14,15-EET组HK-2细胞的caspase-3活性显著降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.05)。4. AKT抑制剂AKTI，PI3K抑制剂LY294002，MAPK抑制剂Apigenin及MEK抑制剂PD98059明显逆转了14,15-EET抑制TNF-α诱导的HK-2细胞caspase-3的活化。结果显示，与未干预的对照组相比，TNF-α处理组HK-2细胞caspase-3活性显著升高(P<0.05)；与TNF-α处理组相比，TNF-α+14,15-EET组HK-2细胞caspase-3活性显著降低(P<0.05)；与TNF-α+14,15-EET组相比，TNF-α+14,15-EET+AKTI组，TNF-α+14,15-EET+LY294002组，TNF-α+14,15-EET+Apigenin组和TNF-α+14,15-EET+PD98059组HK-2细胞caspase-3活性显著降低，差异具有显著性统计学意义(P<0.05),5. Western blot检测的结果显示，TNF-α显著降低了HK-2细胞Bcl-2，PI3K，P-AKT及P-MAPK的表达水平(P<0.05)；但是，8,9-EET，11,12-EET与14,15-EET显著抑制了TNF-α诱导的Bcl-2，PI3K，P-AKT及P-MAPK的表达水平的下降(P<0.05)。6. Western blot检测的结果显示，AKT抑制剂AKTI，PI3K抑制剂LY294002，MAPK抑制剂Apigenin及MEK抑制剂PD98059明显逆转了14,15-EET对HK-2细胞Bcl-2表达水平的上调(P<0.05)。统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准误表示，各分组的组间差异应用单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。结论1. sEH基因敲除减轻糖尿病小鼠肾功能恶化，改善糖尿病引起的肾脏病理改变,减少肾脏细胞凋亡，延缓糖尿病肾病的进展。2. sEH基因敲除显著增加抗凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl的表达水平，降低促凋亡蛋白Bax的表达水平，其分子机制可能是sEH基因敲除激活了PI3K/AKT/NOS3和AMPK信号转导通路。3. sEH基因沉默显著通过上调Bcl-2和Bcl-xl的表达水平，下调Bax的表达水平,抑制TNF-α诱导的HK-2细胞凋亡。4.外源性EETs通过激活PI3K/AKT与MAPK信号通路抑制TNF-α诱导的HK-2细胞凋亡。5. CYP表氧化酶-EETs-sEH系统通过减轻糖尿病肾脏病理改变，保护肾脏细胞的功能，最终延缓肾病的进展，起到治疗糖尿病肾病的作用。