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研究背景:KRAS 是胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,PDAC)中最常突变的癌基因(～95%)。该基因位点的突变对于人类和小鼠的胰腺肿瘤起始和发展是至关重要的。研究曾报道野生型Kras等位基因在PDAC小鼠模型(p16flox/flox;LSL-KrasG12D;Pdxl-Cremice)的原位癌和转移灶均发生了缺失,并且在转移灶缺失野生型KRAS等位基因的缺失频率显著高于原位肿瘤。然而,野生型KRAS等位基因缺失的机制,以及其在胰腺癌发生发展过程中的功能尚不明确。研究目的:1、探索野生型KRAS等位基因在胰腺肿瘤发生发展中的功能。2、探索野生型KRAS等位基因在胰腺癌细胞中对下游分子信号通路调控的机制。研究方法:1、选取已发生野生型KRAS等位基因缺失的人源胰腺癌细胞系(MIAPaCa-2,AsPC-1),稳定转染野生型KRAS等位基因,并可由强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导其目的基因表达的质粒,获得稳转细胞系(iWTKRASMIAPaCa-2,iWTKRASAsPC-1)。2、通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐染色实验(MTT Assay)、克隆形成实验(Colony formation assay)、划痕实验(Scratch assay),在体外观察诱导野生型KRAS表达时,人源胰腺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力以及转移能力的改变。3、通过裸鼠皮下种植野生型KRAS稳转细胞系,并随访测量成瘤的大小。在体内环境中观察回归表达野生型KRAS等位基因后对人源胰腺肿瘤生长的影响。4、通过免疫蛋白印迹法(Western Blot)观察归还野生型KRAS等位基因后对KRAS 基因下游经典调控信号通路(Canonical downstream signaling pathway of KRAS)的改变。5、通过免疫荧光染色法(Immunofluorescent),免疫细胞化学染色法(Immunocytochemistry)标记YAP1,观察回归表达野生型KRAS等位基因之后对YAP1在细胞内定位的改变。6、细胞浆、细胞核分离提取蛋白,通过免疫蛋白印迹法检测回归表达野生型KRAS等位基因后细胞浆、细胞核中YAP1含量变化。7、通过荧光素酶报告基因实验(Dual-Gloluciferaseassay),定量观察在回归表达野生型KRAS等位基因后,内源性YAP 1在细胞核中与TEADs结合量的变化。8、通过对无野生型KRAS等位基因诱导组和野生型KRAS等位基因诱导组样本的mRNA测序分析(RNA Sequencing,RNASeq),比较在稳转细胞系中回归表达野生型KRAS等位基因对蛋白表达谱的改变。9、将由RNA Seq获得的差异性转录基因谱与YAP1-TEADs下游调控靶基因谱比较,筛选出重叠的基因,并从中挑选出部分基因,通过定量即时聚合酶链锁反应法(Quantitative real time polymerase chain reaction,qPCR)验证。10、采用细胞浆/细胞核分离蛋白质谱分析(Cytoplasmic/Nuclear proteomic analysis),检测回归表达野生型KRAS等位基因后细胞浆/细胞核内蛋白表达水平变化。11、通过免疫蛋白印迹法、免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测在回归表达野生型KRAS基因后,内源性YAP1、磷酸化YAP1、14-3-3zeta的表达变化以及磷酸化YAP1与14-3-3zeta结合水平变化。12、将突变型YAP1(激活型YAP1)、野生型YAP1瞬时转染可诱导表达野生型KRAS等位基因的稳定细胞系,观察两种不同的YAP1对细胞恶性程度,包括生长能力和侵袭转移能力的影响。13、通过免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry,IHC)标记YAP1,在人胰腺导管腺癌样本芯片(n=92)中检测YAP1的表达水平,根据H-score评分标准对YAP1在人群样本组织中的表达水平进行评分。根据YAP1表达水平的不同,将人群样本进行分组,并结合样本临床资料分析YAP1基因的表达水平与患者术后生存期等各项指标的相关性。研究结果:1、在已发生野生型KRAS等位基因缺失的人源胰腺癌细胞系MIA PaCa-2、AsPC-1细胞中回归表达野生型KRAS等位基因,获得可通过强力霉素诱导野生型 KRAS 表达的稳转细胞系(iWTKRAS MIA PaCa-2、iWT KRAS AsPC-1)。通过诱导表达野生型KRAS等位基因,观察到稳转细胞系的增殖能力、集落成球能力、细胞移行能力均下降。2、在裸鼠成瘤实验中,回归表达野生型KRAS等位基因的裸鼠肿瘤生长速度降低。3、免疫荧光实验、免疫细胞染色实验、荧光素酶报告基因实验以及细胞核蛋白质朴分析确定,回归表达野生型KRAS等位基因使稳转细胞系中的YAP1核定位减少。4、RNA测序结果筛选出5276个具有统计学意义的差异性转录的基因,与YAP1-TEADs下游调控的目的基因有45.74%(172/376)相重合。从重合部分的基因列表中挑选出部分基因通过qPCR进行验证,在回归表达野生型KRAS等位基因后,YAP1-TEADs下游目的基因转录水平下降。5、回归表达的野生型KRAS通过促进细胞浆中的YAP1在S127位点发生磷酸化,提高磷酸化YAP1与14-3-3zeta的结合水平,从而导致YAP1细胞浆阻滞。6、超表达S127A突变型YAP1在野生型KRAS稳转细胞系中完全逆转了野生型KRAS介导的抑癌变化,而超表达野生型YAP1未能完全逆转野生型KRAS对细胞生长、细胞移行能力的抑制作用。7、YAP1在胰腺导管腺癌人群样本中呈高表达,并与术后生存率呈负相关关系。结论:1、野生型KRAS等位基因在KRAS突变杂合子人源胰腺癌细胞中具有抑制生长、抑制转移的作用。2、野生型KRAS等位基因通过促进细胞浆中YAP1在S127位点的磷酸化,并提高磷酸化YAP1与14-3-3zeta的结合,导致YAP1细胞浆阻滞,YAP1-TEADs下游目的基因表达下降从而发挥抑癌功能。3、YAP1在人胰腺导管腺癌中呈高表达,并与术后生存期呈负相关关系。