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缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国重要的经济养殖贝类之一,主要分布在沿海的中低潮区域。近年来,全球气候变暖,温度上升可能会削弱海洋动物的防御机制并影响其生长发育。作为一种典型的滩涂滤食性贝类,温度过高会引起其相应的应激。高温会引起凋亡的发生,而丝裂原活化蛋白激酶p38（p38MAPK）通路主要作用之一就是调节细胞凋亡,但目前针对贝类p38MAPK作用的研究较少。本研究分析了高温胁迫下缢蛏鳃和肝胰腺组织的氧化应激反应,细胞凋亡和组织损伤情况;通过相关的分子生物学技术鉴定了缢蛏细胞凋亡基因p38MAPK的序列,分析了其表达特征;利用RNAi技术研究高温胁迫下抑制p38MAPK基因对其通路基因以及组织细胞凋亡的调控作用。1.研究28℃、30℃、32℃、34℃高温胁迫对缢蛏ROS含量以及组织凋亡和损伤程度的影响。利用ELISA试剂盒检测活性氧（ROS）在鳃和肝胰腺组织中的表达含量,结果表明温度升高会显著增加ROS含量,其含量均在高温条件6 h下极显著升高,且在34℃下含量最高。在高温胁迫72 h后,采用TUNEL染色观察鳃和肝胰腺组织细胞凋亡情况,发现鳃和肝胰腺组织在28℃下只出现零星荧光信号,随着温度升高,在30℃、32℃、34℃条件下,绿色荧光信号逐渐增强,细胞凋亡程度逐渐增加,且在34℃凋亡程度最大。对鳃和肝胰腺进行组织形态观察,研究结果表明28℃下鳃组织结构完整,随着温度升高,鳃组织中的鳃内腔逐渐变大,34℃下鳃内腔最大;28℃下肝胰腺组织形态完整,30℃条件下肝小管管腔形态开始被挤压,形态被破坏,基膜形态不完整,在34℃下组织损伤程度最严重。研究结果说明高温会激发缢蛏的氧化应激反应,诱导组织细胞凋亡,引起组织损伤,且在高温30℃下机体开始对高温做出反应,在34℃高温下反应最强烈。2.从缢蛏转录组数据库中获取p38MAPK基因片段序列,并进行序列分析和表达水平分析。结果表明p38MAPK基因ORF区为1080bp,其编码359个氨基酸。预测该基因的蛋白分子量（MW）为41.54k Da,理论等电点为（p I）5.39。p38MAPK无信号肽,是非跨膜蛋白。氨基酸组成分析表明,该蛋白有16个丝氨酸磷酸化位点（S）,14个苏氨酸磷酸化位点（T）,6个酪氨酸磷酸化位点（Y）。蛋白质三级结构预测发现该蛋白的α螺旋为40%,β折叠为15%,TM螺旋为4%,无规则卷曲为13%。实时荧光定量检测表明p38MAPK基因在成体七个组织中广泛表达。在34℃胁迫24 h后,七个组织中表达量都有不同程度的升高,且鳃和肝胰腺组织中p38MAPK表达量极显著升高,分别为对照组的2.81和8.83倍。高温胁迫后,缢蛏鳃组织中12 h、24 h、72 h基因表达量显著升高,肝胰腺组织中表达量分别在28℃下24 h、30℃和32℃下6 h、34℃下12 h达到峰值。3.利用RNA干扰技术,进一步探究在高温胁迫下p38MAPK基因的调控作用。通过对p38MAPK基因dsRNA有效干扰链的筛选和有效干扰浓度的筛选,确定了dsRNA-a为此实验的最适干扰链,其干扰浓度为500 ng/μl,干扰率为77%。采用dsRNA注射技术,开展了缢蛏活体干扰实验,并进行高温胁迫实验。结果表明,在鳃和肝胰腺组织中注射干扰链后,MAPK通路下游Bcl-2基因表达水平上升,Bax基因极显著下降;Bcl-2/Bax比例增加;ROS含量极显著降低。在进行细胞凋亡检测后发现,干扰p38MAPK之后鳃和肝胰腺组织的凋亡信号减少,程度降低。结果表明,抑制p38MAPK基因后,机体通过激活p38MAPK-Bcl-2/Bax依赖性凋亡途径,降低组织ROS含量和细胞凋亡程度来发挥作用。