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第一部分引言糖尿病正在成为一种全球性流行病,严重威胁人们健康;其中90%以上为2型糖尿病(T2D)。T2D是一个多因子诱发的疾病,是包括遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。本研究中,我们全面收集、掌握一T2D家族谱系,对其主要成员进行全基因组外显子测序,首次发现、筛选出突变基因——PEBP4;为阐明PEBP4与T2D之间的关系,首先采用生物信息学方法比较PEBP1-4基因序列以及m PEBP4与h PEBP4异同及其特点;为检测PEBP4是否为分泌型,分别将Myc、GFP表位分别放置在PEBP4的N-端/C-端,检测PEBP4在细胞/培养液中表达,以及细胞内的定位;在生物信息学的序列比对中,发现在PEBP4的基因序列中存在N-糖基化位点;运用蛋白质组学、基因定点突变和质谱分析等手段,确认此糖基化位点的作用;为探讨PEBP4 N端-/C-端作用机制,采用sh RNA转染HEK293T沉默PEBP4,使用ERK/Akt激活剂EGF、蛋白免疫印迹等,探讨PEBP4与ERK/Akt的调控关系;最后,我们尚构建敲除PEBP4基因小鼠,筛选纯合子后,观察雌性小鼠体形/体重、空腹血糖、糖耐量能力等指标,初步探讨PEBP4对机体代谢可能的影响,为今后深入研究PEBP4在T2D等代谢性疾病中的作用及其意义奠定理论与实验基础。第二部分糖尿病家族谱系中的PEBP4基因突变目的:全面了解先证者家族中T2D患病情况,有无遗传倾向或是基因突变。方法:根据T2D诊断标准,全面收集、掌握先证者及其家族成员有关症状、体征以及实验室检测结果;对先证者及其兄、弟、妹三人抽外周血作全基因组外显子测序,寻找突变基因及位点。结果:先证者父亲兄弟二人、先证者及其三位兄、弟、妹以及二位堂兄弟和二位堂姐妹均在40岁左右诊断患有T2D;先证者与兄、弟、妹四人均发现PEBP4基因突变。结论:该T2D患者家族遗传倾向极为明显;首次发现T2D家族谱系中存在PEBP4基因突变。第三部分PEBP4——一种分泌型蛋白目的:阐明PEBP4的结构、功能特点以及在细胞内分布及其分泌能力。方法:采用生物信息学方法进行序列比对,PEBP1-4基因以及m PEBP4与h PEBP4异同及其特点;构建C’-/N’-GFP-Myc-PEBP4重组质粒,转染293T细胞;Western-blotting检测PEBP4在293T细胞浆/培养液表达;激光共聚焦显微镜观察PEBP4在293T细胞内分布之改变。结果:序列比对发现:PEBP1-3在基因序列和功能机制是相似的;而PEBP4则很可能是一个结构特殊的、存在不同功能的蛋白;N’末端融合免疫标记物者,PEBP4只能在细胞浆中检测;而C’末端融合免疫标记物者,则可在细胞培养液中检出;当C’末端融合GFP,荧光信号呈点状分布在核周;N’末端融合GFP,显示荧光信号均匀分别在细胞质内。结论:PEBP4是一个分泌型蛋白;N’末端的完整性对其分泌功能是必须的。第四部分PEBP4的糖基化目的:确认PEBP4的糖基化及其位点。方法:采用生物信息学方法进行序列比对,h PEBP4与m PEBP4有无N-糖基化共有序列;对PEBP4-R172/-T172A/-E188进行基因定点突变,构建相应重组质粒,转染293T细胞,Western-blotting检测突变型/野生型PEBP4之表达;蛋白质组学、HILIC LC/MS或是LC-MS/MS检测N-糖基化之改变。结果:生物信息学方法进行序列比对:h PEBP4有一个N-糖基化共有序列(N169KT);m PEBP4则有二个N-糖基化共有序列(N78IS与140IT);突变型序列分子量小于野生型的,表明突变阻止了N-糖基化;HILIC LC/MS或是LC-MS/MS均可检出N-糖基化之相应改变。结论:h PEBP4和m PEBP4在N169KT以及N78IS与140IT确实发生了糖基化。第五部分PEBP4与MAPK-ERK/Akt信号通路目的:探讨PEBP4对MAPK-ERK信号通路以及Akt信号通路的影响。方法:构建PEBP4-sh RNA质粒,下调PEBP4表达;Western-blotting检测:经EGF处理后,或是C’-Myc-PEBP4和N’-Myc-PEBP4分别转染细胞后,ERK1/2和磷酸化ERK1/2以及Akt和磷酸化Akt的表达情况。结果:用PEBP4-sh RNA下调PEBP4表达后,经EGF处理,ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达不变;而Akt的表达不变,但磷酸化Akt的表达随着PEBP4下降减少;C’-Myc-PEBP4和N’-Myc-PEBP4分别转染细胞后,ERK1/2和磷酸化ERK1/2以及Akt和磷酸化Akt的表达均不变。结论:PEBP4不参与EGF引起的ERK激活,但参与了Akt相关信号通路的调控。第六部分敲除PEBP4后雌性小鼠代谢的若干改变目的:初步探讨PEBP4对能量代谢的影响。方法:制备、鉴定敲除PEBP4基因小鼠。取敲除PEBP4基因纯合子雌性小鼠、杂合子雌性小鼠以及野生型雌性小鼠各10只,正常饮食喂养3月后更换高脂饮食;每周定期观察体形,检测体重、空腹血糖及糖耐量试验,8周后统计监测结果。结果:敲除PEBP4基因小鼠可稳定遗传、正常繁殖。敲除PEBP4基因纯合子雌性小鼠体形明显肥胖,体重增加,空腹血糖升高,及糖耐量能力下降。结论:敲除PEBP4基因可引起雌性小鼠代谢出现紊乱。