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猪肌肉组织中能量的贮存、释放、转移和利用是决定肌肉生长发育和猪肉品质的重要因素。水解磷脂酰肌醇(phosphatidyldinositol,PI)的肌醇多磷酸5-磷酸酶家族成员对细胞的糖脂代谢信号和膜运输起重要调节作用。其中骨骼肌和肾脏高表达的5’肌醇磷酸酶(Skeletal muscle and kidney enriched inositol phosphatase, SKIP)和包含SH2结构的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatase, SHIP2)都能通过水解胰岛素介导的脂质第二信使PI(3,4,5)P3,负调控P13K依赖的胰岛素信号通路,是影响动物个体生长速度和肉用品质的候选基因。因此,本研究对猪SKIP和SHIP2基因进行了分离和遗传效应分析,研究了它们的表达调控机理,并运用RNAi方法对SKIP的功能进行了验证,取得了以下结果：1采用电子克隆方法获得两个候选基因的cDNA序列,均包括完整的编码区(CDS)序列：(1)SKIP,获得cDNA序列1575 bp,其中CDS 1353 bp, GenBank登录号GQ504265。(2)SHIP2,获得cDNA序列4411 bp,其中CDS 3795 bp, GenBank登录号为GU391030。根据基因组比较图谱将SKIP基因定位于猪12号染色体SSC 12q1.3,将SHIP2基因定位于猪9号染色体SSC 9p23-24。分析系统进化树,发现猪SKIP与牛进化关系较近,猪SHIP2与狗进化关系较近。2采用RCR-RFLP技术,在不同猪种中对2个候选基因的SNP位点进行基因分型,并在大白×梅山F2代群体中进行性状关联分析。结果表明(1)SKIP,第12外显子G136A位点与皮率,至第一颈椎胴体长,至第一肋胸胴体长呈极显著相关(P<0.01),与肌内脂肪,含水率呈显著相关(P<0.05),第6内含子A17G位点与骨率,内脂率,至第一肋胸胴体长呈极显著相关(P<0.01),与至第一颈椎胴体长呈显著相关(P<0.05)；第1内含子C1092T位点与内脂率,至第一肋胸胴体长,股二头肌大理石纹,肌内脂肪含量呈显著相关(P<0.05),与背最长肌大理石纹呈极显著相关(P<0.01)；(2)SHIP2,第21内含子G410A与皮率显著相关(P<0.05),与肩部最厚处背膘厚,眼肌高,眼肌宽呈极显著相关(P<0.01)。3运用RNA干扰技术和超表达技术研究了SKIP在分化肌细胞C2C12中的功能,Western blot分析发现抑制SKIP的表达使胰岛素介导的Akt(蛋白激酶B)的磷酸化水平、GSK-3β(糖原合酶激酶)的磷酸化水平,和GS(糖原合酶)的去磷酸化水平都有显著提高,同时发现当在肌细胞内超表达外源猪SKIP时,胰岛素介导的糖原合成量显著减少。表明在肌细胞中,SKIP对Akt/GSK-3p/GS介导的糖原合成信号通路起负调控作用。同时也解释了SKIP基因多态影响肉质性状的分子机理。4利用基因组PCR步移方法获得猪SKIP基因转录起始位点上游2075bp的启动子序列。生物信息学分析发现两个潜在的MyoD结合位点,若干Spl结合位点和一个位于起始密码子上游的CpG岛。以启动子序列为模板,用PCR方法获得5个5’侧翼缺失片断构建pGL3-basic的双荧光素酶报告基因载体,并将这些载体分别转染C2C12成肌分化前体细胞和肌管细胞,荧光素酶活性分析推测在启动子的-1845到-1171和-1171到-737两处地方存在转录抑制元件,在-2038到-1845处存在潜在的转录增强子。5半定量分析发现,SKIP在成年大白猪肌肉组织中高表达,并且在骨骼肌细胞的分化过程中表达上调。利用定点突变和RNA干扰技术,分析了SKIP启动子中潜在E-box元件和转录因子MyoD对SKIP转录的影响。发现突变E-box元件和抑制MyoD的表达都显著降低了肌管细胞中SKIP启动子的活性,表明MyoD可能通过顺式作用元件E-box介导SKIP在肌管细胞中的上调表达,并且TGF-β也以MyoD依赖的方式调控SKIP的转录。6利用RNA干扰技术分析了转录因子Spl对SKIP的转录影响。定量分析发现Spl基因的表达抑制使SKIP启动子活性显著下降,表明转录因子Spl可能通过顺式作用元件GC-box对肌肉细胞分化过程中SKIP基因的转录激活起正向调控作用。同时,SKIP启动子活性在Spl和MyoD双重表达抑制的肌细胞中与在Spl或MyoD单一表达抑制的肌细胞中相比,差异不显著,表明Spl可能与MyoD家族成员协同激活肌细胞分化过程中SKIP的表达。7利用猪基因组信息,分离获得猪SHIP2基因转录起始位点上游1820 bp的启动子序列。生物信息学分析发现Sp1, E2F, MyoD, E47, E2等转录因子的潜在结合位点和覆盖整个启动子区的CpG岛。以启动子序列为模板,用PCR方法获得5个5’侧翼缺失片断构建pGL3-basic双荧光素酶报告基因载体,并将这些载体分别转染C2C12成肌分化前体细胞和肌管细胞,荧光素酶活性分析推测在启动子的-1849到-1742存在转录抑制元件,在-1742到-1694处存在转录增强元件,从-1742到-1266处476bp序列已足够使SHIP2正常转录。8半定量分析发现SHIP2在成年大白猪的肌肉组织中高表达,定量分析发现SHIP2在骨骼肌细胞的分化早期表达上调而在分化中晚期表达下调。利用RNA干扰技术,分析了转录因子MyoD和Spl对SHIP2转录的影响。MyoD或Spl的表达抑制均显著降低了SHIP2的启动子活性,表明转录因子MyoD和Spl均能促进SKIP启动子在肌管细胞中的表达活性。利用定点突变技术分析了E2F作用元件对SHIP2启动子活性的影响,发现突变的E2F结合元件导致SHIP2启动子在成肌前体细胞中的活性下降,而在肌管细胞中的活性提高。表明转录因子E2F可能具有双向调控作用,在成肌前体细胞中促进SHIP2基因的转录,而在肌管细胞中抑制SHIP2基因的转录。