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目的：川崎病(Kawasaki disease,KD)主要病理改变为全身非特异性血管炎,其病因未明；免疫细胞过度激活产生的多种细胞因子介导的促炎与抗炎症反应失衡对川崎病的发生发展和冠状动脉损伤起着重要作用。E-选择素(E-selectin,ES)是新近发现的一种炎症细胞因子,是黏附分子选择素家族主要成员之一,为细胞表面糖蛋白,参与白细胞粘附和聚集,它在免疫、炎症中起着重要作用。可溶性E-选择素表达增加与许多炎症情况有关,通常认为E-选择素水平变化反映了细胞表面成分的翻转和蛋白质的水解,可作为疾病活动的标志。近年研究发现：细胞因子基因位点单核甘酸多态性可影响个体细胞因子产生水平和反应强度。E-选择素+A561C基因多态性可影响个体E-选择素产生水平和反应强度,与心血管疾病,免疫性疾病关系密切。而与川崎病发病的关联,国内外尚无系统研究。本研究通过检测川崎病患者可溶性E-选择素变化,探讨其在川崎病病情监测与冠状动脉病变程度的作用,以及E-选择素+A561C位点单核甘酸多态性与川崎病发病及冠脉损害以及对E-选择素水平的影响。
方法：
1.实验对象:KD组148例、发热对照组20例和健康对照160例,其中KD组包括冠状动脉损伤组(coronary artery lesion,CAL)78例和非冠状动脉损伤组(no coronary artery lesion,NCAL)70例。
2.标本留取：各组实验对象入选时采乙二胺乙酸(EDTA)抗凝血2-3ml,分离出血浆和血细胞后分别置于-80℃保存。
3.冠状动脉内径测定：有彩超室专人负责,常用胸骨旁主动脉根部短轴切面和胸骨旁左心长轴切面显示左冠状动脉和右冠状动脉主干和开口。急性期(3～7天)、治疗后亚急性期(14天)和恢复期(34天)测量冠状动脉内径。
4.血浆ES水平检测：实验对象血浆用ELISA双抗夹心法检测ES水平。
5.血细胞DNA提取：按照全血基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA。
6.+A561C基因多态性分析：应用PCR/RFLP法检测,以外周血基因组DNA为模板进行PCR扩增,PCR上下游引物序列参照参考文献设计。PCR反应产物用限制内切酶酶切,酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下判断结果。
7.PCR产物回收和测序：按胶回收试剂盒说明回收,基因产物测序。
8.统计学处理：试验数据采用均数±标准差(x±s)表示。两组计量资料的显著性检验用t检验。计算对照组川崎病组各等位基因频率,然后经Hardy-Weinburg遗传平衡定律检验,检验各基因型频率是否已达遗传平衡具有群体代表性。各组间构成比差异采用x2检验。各组的基因型的关联强度以相对危险度(Relative risk,RR)代表,RR值95％置信区间(Confidence interval,CI)的计算采用Woolf法。对所有数据运用SPSS13.0统计软件进行分析。P<0.05为有统计学意义。
结果：
1.川崎病组E-选择素与发热组、对照组比较：急性期(193±29ng/ml)、亚急性期(150±48ng/ml)均高于发热组(115±23ng/ml)和健康对照组(80±16ng/ml),各组间差异有显著性(P<0.01);急性期冠脉损伤组(226±36ng/ml)E-选择素水平明显高于无冠脉损伤组(158±31ng/ml)差异有显著性(P<0.01)(t检验)。亚急性期(174±46vs125±28ng/ml);恢复期(108±15vs83±19ng/ml)差异无显著性。
2.研究对象中E-选择素基因+A561C多态性位点存在AA,AC二种基因型,PCR产物测序结果与基因库序列相一致。AA基因型发生频率最高(148/160,92.5％AC),基因型频率次之(12/160,7.5％),这种基因多态性分布在男女间差异均无显著性(P>0.05)。经Hardy-Weinburg遗传平衡定律检验,表明各基因型频率已达遗传平衡具有群体代表性。
3.E-选择素+A561C各基因型分布以及等位基因频率在KD组和对照组之间比较差异无显著性(P>0.05),在与合并冠状动脉损伤组间比较无显著性(P>0.05)。KD组AC基因型携带者与AA基因型的ES水平无显著差异。
结论：
1.E-选择素与川崎病以及冠脉损伤的发生、发展关系密切,ES具有预示KD患儿CAL潜在的可能性。
2.研究对象中存在E-选择素+A561C位点基因多态性,未发现E-选择素+A561C位点基因多态性与川崎病的相关性。