第一章、绪论　　 组织工程膀胱的研究已经有十余年的历史,在种子细胞的培养、支架材料的制备等方面已经取得了巨大的进步,并且已经初步用于临床。然而,目前组织工程膀胱的研究和应用主要还面临着平滑肌再生欠佳、血管化较慢和不充分的困难。针对这一难点,设计了本课题,旨在联合使用多种途径以促进组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化,并初步探讨其作用机制。　　 本论文正文分为5个部分,下面将分别予以陈述。　　 第二章、组织工程膀胱种子细胞的分离和培养　　 我们采用酶消化法从膀胱癌患者分离和培养人膀胱平滑肌细胞(humanbladder smooth muscle cell,HBSMC),动态观察细胞形态变化。采用免疫细胞化学观察平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)和结蛋白(desmin)表达的变化,同时观察有无广谱细胞角蛋白(Pan Cytokeratin)的表达,以及观察血清饥饿培养对HBSMC的形态和SMA和desmin的表达的影响。　　 我们采用酶消化法分离和培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC)。采用免疫细胞荧光染色,观察HUVEC的形态学特征和表达(von Willebrand Factor(vWF)和内皮型的一氧化氮合酶(endothelial nitricoxide synthase,eNOS)的情况。　　 我们采用密度梯度离心分离脐血单个核细胞,然后进行人脐血内皮祖细胞(human endothelial progenitor cell,HEPC)的诱导培养。观察HEPC的形态学特征,观察HEPC摄取DiI-ac-LDL和结合FITC-UEA-1的能力。采用免疫荧光染色观察HEPC表达vWF和eNOS的情况。采用流式细胞术观察HEPC表达CD133,CD34,KDR,CD31,CD105,CD146,CD51/61,CD144,CD14和CD45的情况。　　 结果显示:原代的HBSMC为贴壁生长的长梭形细胞。第2代HBSMC不表达Pan Cytokeratin,而表达SMA和desmin的阳性率分别高达99±0.8％和97±2.1％。随着传代次数增加,HBSMC逐渐去分化。HBSMC的形态变成短梭状或椭圆形,且SMA和desmin的阳性率开始下降。经血清饥饿培养48小时后,HBSMC细胞又能再分化,形态上变为长梭形,SMA和desmin阳性率会显著上升(p＜0.05)。　　 所培养的HUVEC呈短梭形,表达vWF和eNOS。所培养的HEPC为鹅卵石形。HEPC既能摄取Dil-AcLDL,又能结合FITC-UEA-1。HEPC不仅表达内皮祖细胞的特异标记CD133,CD34,KDR;而且还表达内皮细胞特异性的标记vWF,eNOS,CD31,CD105,CD146,CD51/61和CD144。另外,HEPC不表达CD14和CD45。　　 上述结果表明:我们所培养的HBSMC,HUVEC和HEPC具有较高的纯度,是进行组织工程膀胱研究的良好的种子细胞。　　 第三章、通过细胞生物学的方法评价无细胞基质中保留的生物活性因子　　 我们制备了一种无细胞基质-猪小肠粘膜下层(small intestinal submucosa,SIS),培养了HBSMC和HUVEC作为组织工程膀胱的种子细胞,然后利用细胞生物学的实验技术来观察SIS中的生物活性成分对HBSM和HUVEC的活性的调节作用,以此来评价该无细胞基质对于膀胱平滑肌再生和血管化的潜在价值。　　 我们的实验结果显示:SIS中的生物活性成分能促进HBSMC和HUVEC的粘附、增殖和迁移;还能促进HUVEC在基质胶上成管。这表明,我们所制备的猪SIS可能保留有一些生物活性因子。这些生物活性因子包括了促进细胞粘附、有丝分裂、迁移和成血管的因子。利用该SIS作为支架材料进行膀胱替代后,这些保留的生物活性因子将在促进组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化中发挥积极的作用。　　 因此,通过细胞生物学的途径能评价无细胞基质中是否保留有生物活性因子以及预测这些生物活性因子对组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化的潜在作用。　　 第四章、组织工程膀胱支架材料的制备　　 第一节、保留有生物活性因子的猪膀胱无细胞基质的制备　　 我们通过一系列物理、化学和酶的方法,制各了一种保留有生物活性因子的猪膀胱无细胞基质(bladder acellular mathix,BAM)。将整个猪膀胱先用胰酶处理以去除尿路上皮层,然后用低渗液和含Triton X-100的高渗液处理以去除细胞膜和细胞浆的成分,最后用核酸酶降解细胞核的核酸成分。在上述脱细胞的过程中,我们采用了膀胱扩张技术和振荡洗涤以增强脱细胞的效率。同时,我们还采用了一系列的措施以抑制脱细胞过程中的蛋白酶的活性。这些措施包括限制振荡洗涤的时间、使用蛋白酶抑制剂、控制洗涤液的PH值和温度,将支架材料冻干、利用环氧乙烷气体灭菌、低温保存。　　 我们的结果表明:利用上述脱细胞的方案能彻底去除猪膀胱组织中的细胞成分,并能很好的保留猪膀胱细胞外基质中的生物活性因子。我们通过细胞生物学的实验评价这些生物活性因子。结果发现,这些保留的生物活性因子能释放到培养基中,并能促进HBSMC和HUVEC的增殖和迁移。我们进一步对猪BAM中保留的生物活性因子进行了定量检测,还检测了猪BAM的胶原和硫酸糖胺聚糖(sulfated glycosaminoglycan,sulfated GAG)含量。结果表明:猪BAM中保留的生物活性因子的含量与其中的sulfated GAG含量呈正相关。这表明,无细胞基质中的sulfated GAG含量可能决定了无细胞基质中保留的生物活性因子的含量。　　 综上,本研究中我们制备了一种保留有生物活性因子的猪BAM。这种保留有内源性的生物活性因子的猪BAM作为组织工程膀胱的支架材料,具有促进组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化的潜力。　　 第二节、猪膀胱无细胞基质的超微结构分析　　 我们采用了扫面电镜技术观察猪BAM的孔结构,并进行了孔径大小的测量。利用比重瓶法进行了孔隙率的测量。并用HBSMC和HUVEC作为种子细胞,观察种子细胞在该猪BAM中的侵入和分布情况。　　 扫面电镜检测发现,猪BAM的孔结构形状不规则,大小不等。X-axis的孔径大小范围在17-276μm(平均101±48μm),y-axis的孔径大小范围在27-261μm(平均92±46μm)。孔径分布分析的结果表明,孔径大小的分布类似于正态分布;75％的孔结构的孔径大小在50-150μam的范围。猪BAM的孔隙率较高,达到了90.6±3.3％;而且,猪BAM的孔结构之间还相互连接。在HBSMC和HUVEC接种之后,HBSMC和HUVEC均能快速地侵入到猪BAM的内部。HBSMC聚集在孔径较大的孔结构之内,HuVEC生长在较小的孔结构的表面,形成单层样结构。　　 上述结果表明,我们所制备的猪BAM具有合适的多孔样的结构特征,能满足组织工程膀胱的需求。　　 第五章、外源性生物活性因子对组织工程膀胱种子细胞的作用　　 我们选用四种不同的外源性生物活性因子:Vascular endothlelial growth factor(VEGF),Basic fibroblaSt growth factor(bFGF),Platelet-deriVed growth faLctor-BB(PDGF-BB)和Platelet-derived growth factor-CC(PDGF-CC),利用HBSMC,HUVEC和HEPC作为种子细胞,通过体外的细胞生物学的技术,观察这四种生物学活性因子对这三类种子细胞的增殖和迁移活性的影响。　　 我们的结果表明:在这四种生物活性因子中,PDGF-BB促进人膀胱平滑肌细胞增殖和迁移的作用最强;VEGF促进人脐静脉内皮细胞和人脐血内皮祖细胞增殖和迁移的作用最强。该研究提示,这两种外源性的生物活性因子在组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化方面有着重要的意义。　　 第六章、同源自体内皮祖细胞联同外源性生物活性因子促进组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化　　 本研究中,我们利用多孔的保留有生物活性因子的猪BAM作为组织工程膀胱的支架材料,选用新西兰白兔作为实验动物,分离和培养了同源自体的兔膀胱平滑肌细胞(rabbit bladder smooth muscle cell,RBSMC)和同源自体的兔外周血内皮祖细胞(rabbit endothelial progenitor cell,REPC)作为组织工程膀胱的种子细胞,同时利用外源性的生物活性因子PDGF-BB和VEGF,以观察联合使用这些途径(实验组)对促进组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化的作用。未接种REPC,同时也不使用外源性的生物活性因子,利用直接接种RBSMC的猪BAM进行膀胱替代的白兔作为对照组。　　 我们的结果显示,膀胱替代术后1个月,实验组和对照组的替代区的尿路上皮再生良好。实验组中,接种的REPC能在替代区直接形成血管样的结构。术后3个月,实验组的替代区的新生血管的面积和数目均明显高于对照组(p＜0.05)。术后3个月和6个月,实验组的膀胱功能恢复明显好于对照组(p＜0.05)。术后3个月和6个月,实验组的替代区的平滑肌密度也明显高于对照组(p＜0.05)。　　 我们的结果表明,联合使用多种途径(支架材料,内皮祖细胞和外源性生物活性因子),能促进组织工程膀胱的平滑肌再生,促进组织工程膀胱的血管化,并改善组织工程膀胱的功能。　　 全文结论　　 本研究中,我们成功地进行了组织工程膀胱的种子细胞(HBSMC,HUVEC,HEPC,RBSMC,REPC)的分离和培养。这些种子细胞能满足组织工程膀胱体内、体外研究的需要。　　 我们以猪小肠粘膜下层为例,提出以细胞生物学的技术评价保留在无细胞基质中的生物活性因子的方法。　　 我们制备了一种保留有内源性的生物活性因子的猪膀胱无细胞基质,该猪膀胱无细胞基质还具有合适的多孔样的结构,能满足组织工程膀胱的支架材料的需要。　　 我们的研究还提示PDGF-BB和VEGF在组织工程膀胱的平滑肌再生和血管化方面有着重要的价值。　　 我们的研究还发现,以多孔的保留有生物活性因子的猪膀胱无细胞基质作为支架材料,再联合使用内皮祖细胞和外源性生物活性因子,能够促进组织工程膀胱的平滑肌再生,促进组织工程膀胱的血管化,改善组织工程膀胱的功能。　　 本课题为进一步进行组织工程膀胱的研究和临床应用又积累了一些经验。