研究背景真菌性角膜炎是由致病性真菌引起的感染性角膜病。真菌对角膜的穿透作用较强,错误的诊断和不当的治疗将引发感染溃疡加重,导致角膜穿孔继发严重的眼内炎,最严重的将导致失明。目前研究已发现70余种可引起角膜炎的真菌。在欧美等发达国家及寒冷地带,致病菌最常见为白色念珠菌,而在许多发展中国家和亚热带及热带地区,最常见的致病菌常为镰刀菌属和曲霉菌属。在我国,烟曲霉菌引起的角膜感染占真菌病原体的21.3%。真菌性角膜感染后,需要进行角膜移植术的病人中,42-60%为烟曲霉菌感染。因此本课题分别选取白色念珠菌和烟曲霉菌作为目标菌株,通过动物实验进行探究。正常的人眼在天然免疫（固有免疫）的保护下,极少发生真菌感染。众所周知,机体的天然免疫功能在抵抗真菌感染和控制炎症进展中发挥了极其重要的作用。因此深入探索角膜免疫防御体系,全面揭示天然免疫中各成分之间的关系,通过研究免疫途径找到机体抵抗真菌感染的作用机制,对于预防和控制真菌性角膜炎的发生发展有着至关重要的临床意义。眼表的天然免疫屏障分为3层,泪膜的脂质层和水液层及角膜上皮细胞。角膜上皮是角膜抵抗真菌的第一道细胞屏障,众多的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）分布在上皮细胞表面,他们具有识别病原微生物表面的病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMPs）的功能。不同结构的PRRs可以特异性的结合相应微生物的PAMPs,使机体发现病原菌的入侵,启动免疫机制从而发挥抗真菌的作用。多年来,通过对角膜抗真菌感染天然免疫的功能及调控进行系统和深入的研究,我们研究团队证实角膜上皮细胞表达两类识别真菌最重要的PRRs。其中Toll样受体（Toll like receptor,TLRs）主要分布于细胞膜,而NOD样受体（NOD like receptors,NLRs）则位于细胞内,二者通过激活下游分子通路如NF-κB通路,诱导炎性因子和抗菌肽分泌从而抵御真菌入侵。目前发现Toll样受体有11种,其中角膜上皮中发现TLR1,TLR2,TLR3,TLR5,TLR6和TLR9在基因水平有较强的表达,但在蛋白水平仅可检测TLR2,TLR4和TLR5的表达。本课题组之前的研究证实,角膜上皮的TLR2和TLR4可识别烟曲霉菌启动角膜抗真菌的天然免疫,并介导下游一系列炎症因子的产生。烟曲霉菌可通过TLR2促进NOD2的表达,LPS还可通过诱导的角膜基质细胞再编程,对TLR4下游信号转导通路进行调控。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）是一种淋巴细胞生长因子,在多种自身免疫性疾病、过敏性疾病及感染类疾病中均扮演重要角色。本课题组前期研究已证实,在体外培养的人角膜上皮细胞系中,TLR的配体可刺激TSLP的分泌,增强角膜对抗真菌感染的天然免疫能力。同时发现,TSLP可促进B淋巴细胞及T淋巴细胞的增殖和分化,参与真菌性角膜炎的获得性免疫过。基于以上初步实验结果,本课题将第一部分研究重点集中于探索在实验动物体内,TSLP与天然免疫中的TLR2,TLR4对抗角膜真菌感染的协同作用,意图揭示TSLP与Toll样受体共同参与真菌性角膜炎的免疫过程和分子机制。我们研究还发现另一种炎症因子IL-36通过抑制IL-1β在角膜抗真菌感染天然免疫中具有保护性作用。IL-36亚家族是新近命名的促炎性细胞因子,其成员包括IL-36α、IL-36β、IL-36γ和IL-36Ra,其结构模型与经典的1L-1家族相似,可由上皮细胞、单核细胞、B细胞和T细胞等多种细胞类型产生。IL-36R存在于DCs和初始T细胞上。研究表明,IL-36α、IL-36β和IL-36γ是IL-36R的激动剂,结合后可激活NF-κB、MAPK、Erk1/2和JNK等通路;而IL-36Ra是天然存在的IL-36R拮抗剂。有研究发现烟曲霉菌可上调PBMCs中IL-36β、IL-36γ和IL-36Ra的表达。其中,IL-36γ表达的上调依赖于Dectin-1/Syk通路和TLR4通路。天然免疫中IL-36能诱导小鼠的骨髓来源树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells,BMDC）产生 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-23 等炎症因子,这些以 IL-6和IL-23为主的炎症因子可促进Th0向Th17方向分化。有研究体外实验发现IL-36α和IL-36β可增强IL-17A的抗菌作用,而IL-17A、IL-22和TNF-α可反过来上调IL-36α、IL-36β和IL-36γ的表达。这些研究提示我们IL-36可能参与了机体抗真菌感染免疫反应,可诱导DCs产生细胞因子,对多种天然免疫细胞产生作用,同时存在天然免疫与IL-36互相调节的作用。课题第二部分将着重研究IL-36在白色念珠菌角膜炎中的功能和在白色念珠菌感染介导的炎症中对角膜天然免疫的调节机制。本课题通过对TSLP和IL-36家族因子在小鼠角膜感染模型中的的深入研究,全面揭示该两种因子调控真菌感染引发的炎症及天然免疫应答中发挥的免疫调控作用。第一部分TSLP在角膜抗烟曲霉菌感染免疫应答中通过调节Toll-like 2,Toll-like 4受体表达,抗菌肽的表达及免疫细胞的趋化作用调控角膜天然免疫目的:体内实验探究TSLP在小鼠角膜的烟曲霉菌感染天然免疫中发挥调控作用及其机制。方法:1.烟曲霉菌菌种和菌丝制备:烟曲霉菌菌株来自中国典型培养物保藏中心。将冻存的菌种复苏后,接种于固体的沙氏琼脂培养基。在37℃条件下培养。24小时后,收集孢子以108个/mL的浓度接种于沙氏液体培养基,接种的试管26℃,200rpm,摇床培养18小时以上,活菌丝悬液。将菌丝悬液1000g离心10分钟得到的菌丝体漂洗2次后悬浮于PBS溶液中,56℃加热灭活60分钟。菌丝以组织匀浆器研磨成20-40μm片段,用PBS将浓度调整为2×106个菌丝体片段/mL,即制成灭活的烟曲霉菌悬液。2.细胞的培养及灭火菌丝刺激:永生化HCECs由Fu-shin Yu教授慷慨提供。HCECs细胞在37℃温度中含有5%CO2的湿润条件下,用50%不含血清的DMEM培养基混合50%KSFM培养基培养。将细胞以4×105个/孔的密度,接种于6孔培养板,待生长至80%融合（2天左右）可用于刺激试验。骨髓提取间充质细胞,以GM-CSF刺激诱导7天后用于菌丝刺激实验。灭活菌丝2×106个菌丝体片段/mL,刺激HCECs6h后收取细胞上清及细胞匀浆用于下游抗菌肽hBD2,hBD9,IL-6,及IL-8检测。3.小鼠烟曲霉菌角膜感染模型建立及临床评估:选取烟曲霉菌及6周龄C57小鼠“角膜接触镜辅助角膜划伤法”,制作小鼠的角膜真菌感染模型,滴加菌液5uL/眼,含有真菌的浓度为108cfu/mL。角膜表面加盖parafilm制作的角膜接触镜。术后缝合小鼠睑裂,12h或24h后打开眼睑,分别于感染后12hpi、1、2、3、5、7和10 dpi于裂隙灯显微镜下观察角膜感染情况,予以临床评分。4.TSLP表达及TSLP对下游因子和受体作用检测:收取感染后的小鼠眼球,行冰冻切片,进行免疫荧光化学染色,观察角膜组织中TSLP,TSLPR表达及角膜的病理变化;以qPCR,WB和ELISA分别检测TSLP及TLR2、TLR4表达变化。以TSLP siRNA和小鼠重组TSLP蛋白分别预处理小鼠角膜,检测TLR2,TLR4,CXCL1,CXCL2,IL-6,CXCL8及中性粒细胞浸润程度变化。结果:1.HCECs产生并分泌TSLP,HCECs细胞表面表达TSLP受体:HCECs与DC细胞经灭活烟曲霉菌菌丝悬液刺激后6h,HCECs细胞上清液及细胞匀浆中western blot检测出TSLP及分泌性TSLP表达,DC细胞上清液及细胞匀浆中未检测出TSLP;细胞免疫荧光显示,相比于PBS对照组,烟曲霉菌刺激可明显介导HCECs产生TSLP和TSLPR的表达;人重组TSLP蛋白刺激HCECs后,表面TSLPR表达增多。这表明角膜上皮细胞为TSLP的主要来源,而树突状细胞极少量分泌TSLP,同时TSLP对上皮细胞通过其表面表达的TSLPR可产生直接作用,或可存在TSLP表达的正反馈循环。2.TSLP调控HCECs中抗菌肽和炎性因子表达:分别用乱序siRNA和TSLP siRNA预处理HCECs细胞后予以烟曲霉菌菌丝悬液刺激12h,收集细胞上清液经ELISA检测显示,干扰TSLP表达可引起hBD2,IL-6,和IL-8下调,hBD9上调。据此推测TSLP在天然免疫中发挥了促进炎症的作用,干扰其表达或可减轻感染引起的炎症反应。3.体内实验中TSLP由角膜上皮分泌并作用于DCs调节角膜溃疡严重程度:小鼠角膜烟曲霉菌感染介导角膜上皮TSLP表达,角膜病变高峰期为真菌感染后1-3dpi,出现明显的角膜中央角膜水肿云翳、角膜缘新生血管等典型真菌性角膜炎临床症状。感染角膜冰冻切片的免疫荧光染色示TSLPR在角膜上皮层表达,同时可与角膜基质DCs共染,表明DCs表面表达TSLP受体,是TSLP的靶细胞。下调TSLP可显著减轻角膜感染严重程度,临床评分降低,角膜真菌负荷量减少,MPO活性降低,提示炎症细胞浸润减少。而上调TSLP具有相反效果,严重激化感染后角膜的免疫反应伴随上述指标上升从而导致严重的炎症破坏。4.TSLP通过调控Toll样受体,抗菌肽,及炎性趋化因子的表达介导角膜抗真菌天然免疫:分别以TSLP的siRNA和小鼠重组TSLP蛋白在感染前24和4小时行结膜下注射,之后以烟曲霉菌的活菌丝悬液接种划伤小鼠角膜。取第1天感染角膜行western blotting,冰冻切片免疫荧光,及ELISA检测。Western blotting结果显示干扰TSLP的表达TLR2几乎不受影响而TLR4明显减少,TSLP重组蛋白可刺激TL2及TLR4上调,同时TSLP siRNA可抑制CXCL1,CXCL2,和CXCL8的表达,进而抑制中性粒细胞浸润和验证程度。重组TSLP蛋白则促进炎性趋化因子的分泌,从而促进中性粒细胞在感染病灶部位大量浸润,使感染引发的角膜溃疡进一步恶化。结论:角膜烟曲霉菌感染后介导角膜上皮细胞产生TSLP,其受体TSLPR表达在角膜上皮细胞及树突细胞表面。TSLP可刺激TLR2、TLR4表达上调,使TLR2、TLR4下游炎症因子IL-6、IL-8分泌增多,加剧天然免疫反应强烈程度。同时大量促进CXCL1,CXCL2,CXCL10等趋化因子的分泌,募集中性粒细胞,抑制抗菌肽发挥的保护作用,从而加重炎症使真菌性角膜炎临床症状恶化。TSLP可加重由TLR2、TLR4介导的天然免疫,在角膜抗真菌感染免疫和炎症的平衡中起到重要的调节作用。第二部分IL-36γ/IL-36R在角膜白色念珠菌感染天然免疫中发挥重要的保护作用目的:体内实验探究IL-36在角膜抗白色念珠菌感染天然免疫中发挥保护性作用的机制。方法:1.白色念珠菌菌种和菌丝制备:该白色念珠菌菌株购自美国国家模式培养物集存库。将菌种接种于沙氏琼脂培养基,25℃条件下培养3天。收集孢子接种于沙氏液体培养基,25℃下200rpm,摇床培养24小时后得活菌丝悬液。将菌丝悬液1000g离心3分钟得到的菌体漂洗2次后悬浮于PBS溶液中,用PBS将浓度调整为2×107个菌体/mL,制成活的白色念珠抗原刺激液。2.动物烟曲霉菌角膜感染模型建立及临床评估:选取6-8周龄C57小鼠“角膜划线法”建立小鼠角膜白色念珠菌感染模型,接种菌液浓度为2×1 07cfu/mL,5uL/眼,分别于感染后6,9,18,和24 hpi于裂隙灯显微镜下观察角膜感染情况并照相,予以临床评分。3.IL-36家族表达及IL-36R受体检测:取各时间点的感染角膜,以western blotting,regular PCR,以及real-time PCR以检测IL-36家族个分子在mRNA和蛋白水平的表达变化。在发现IL-36γ于感染后表达明显增多,且持续时间较长,可以至24hpi。以体外重组IL-36γ结膜下注入刺激18h,取小鼠感染眼球,行冰冻切片免疫荧光化学染色观察角膜组织中IL-36R和四种免疫细胞——树突细胞,巨噬细胞,自然杀伤细胞,和中性粒细胞的共染情况,观察IL-36R分布与免疫细胞类型的关系,明确IL-36因子的来源及其作用靶细胞。4.IL-36R缺失对角膜感染临床表现影响的功能实验以及对下游因子作用影响的检测:以与之前实验浓度相同的白色念珠菌菌液感染IL-36R基因敲除小鼠,于6hpi刮取被感染的角膜上皮冻于液氮,18hpi剪取感染的全角膜用于下游因子检测,24hpi取被感染的全角膜估计疾病程度。以试剂盒提取角膜上皮中的mRNA,以用于对 IL-1β,IL-1Ra,S100A8,和 S100A9 行 real-time PCR 检测。用 RIPA 裂解法,提取18hpi被感染的全角膜,以PBS制成组织均浆,离心后得组织蛋白提取液,以ELISA检测IL-1β和S100A8/9的蛋白水平。24hpi的角膜被用于均浆后进行真菌负荷量的检测和MPO活性测定。冰冻切片染色观察IL-36R对中性粒细胞的作用。5.体外IL-36γ对角膜感染疾病程度以及下游因子的影响检测:将小鼠重组IL-36γ蛋白预先18h结膜下注射,之后进行角膜划伤以及白色念珠菌接种。IL-1β,IL-1Ra,S100A8,和S100A9行real-time PCR检测,提取18hpi被感染的全角膜,以PBS制成组织均浆,离心后得组织蛋白提取液,以ELISA检测IL-1β和S100A8/9的蛋白水平。24hpi的角膜被用于均浆后进行真菌负荷量的检测和MPO活性测定。6.蛋白质组学对比IL-36 γ/IL-36R对真菌感染后角膜中其他大量分子的影响差异:分别将小鼠分成四组,a空白对照组,b野生型普通感染,c鼠重组IL-36γ预处理组,和d IL-36R基因敲除组。提取蛋白,用于蛋白质信片的检测,检测出的差异蛋白——Reg3g,PTX3,以及IL-33再以Western检测以上结果。结果:1.IL-36主要由角膜上皮表达并分泌,巨噬细胞及DC细胞表面表达IL-36受体:在小鼠角膜白色念珠菌感染模型中,通过PCR及EB凝胶电泳显示IL-36家族因子在感染后6-9小时开始表达,IL-36γ在18小时表达量明显增加,并持续表达至感染后24小时。IL-36α在感染角膜可检测出明显的表达曲线,IL-36β和天然的IL-36受体拮抗剂IL-36Ra在感染后表达变化微弱。角膜上皮感染6小时提取RNA检测,IL-36α,β,γ均有升高,其中γ变化最为明显。Western blotting进一步证实IL-36γ和IL-36受体在感染后蛋白水平的表达相应增加。以小鼠重组IL-36γ蛋白预处理小鼠角膜18小时候,行冰冻切片检测出IL-36受体与CD11c+细胞,NK1.1+细胞及F4/80+细胞共定位,说明巨噬细胞,自然杀伤细胞及树突细胞表面表达IL-36受体,是IL-36γ下游效应细胞。中性粒细胞未检测到于IL-36受体共定位,但可以被IL-36γ从角膜边缘趋化至角膜中央位置。证明中性粒细胞可间接被IL-36γ调控。2.IL-36R缺失加重角膜感染程度并调控下游因子表达:IL-36R基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,白念珠菌感染后临床评分升高,角膜水肿溃疡恶化,真菌量增多,MPO水平和活性提高,炎症程度明显加重中性粒细胞浸润增多,巨噬细胞趋化聚集在病灶位置,树突细胞和自然杀伤细胞趋化受损,不能及时趋化到病灶部位发挥清除真菌的作用,局部上皮及基质破坏严重。炎性因子IL-1β RNA及蛋白水平升高,保护性因子IL-IRa和抗菌肽S100A8,S100A9在RNA及蛋白水平下降。3.体外重组IL-36γ蛋白保护感染后角膜,促进下游保护性因子表达,抑制过度炎症反应:以结膜下注射的方式将重组的IL-36γ蛋白预先处理小鼠角膜后进行白念珠菌感染,至第一天观察至第七天发现IL-36γ可明显减轻真菌感染引起的炎症反应,主要表现为角膜溃疡浑浊及水中减轻,角膜清晰度明显增加,临床评分降低,真菌负荷量减少,MPO活性降低,中性粒细胞浸润减少。对下游炎性因子进行检测发现IL-1βRNA及蛋白水平降低,保护性因子IL-1Ra和抗菌肽S100A8,S100A9在RNA及蛋白水平上升,巨噬细胞趋化因子CCL3 RNA及蛋白水平下降,保护性因子TNFaIP3 RNA水平上升。4.IL-36 γ/IL-36R影响炎症因子IL-33,抗菌肽Reg3g和PTX3的表达:分别将小鼠分成四组,a空白对照组,b野生型普通感染,c鼠重组IL-36γ预处理组,和d IL-36R基因敲除组。提取蛋白,用于蛋白质芯片的检测,检测结果显示,IL-36γ/IL-36R可调节抗菌因子Reg3g,PTX3,以及炎症因子IL-33的表达。IL-36γ/IL-36R可分别不同程度的上调Reg3g,PTX3,并且下调IL-33。为验证以上结果,以Reg3g,PTX3,和IL-33的抗体行Western blotting及琼脂糖凝胶电泳显示与蛋白芯片相同趋势的结果。结论:角膜白色念珠菌感染后介导角膜上皮细胞产生IL-36α,β及γ,其受体IL-36R表达在角膜上皮,树突细胞及巨噬细胞表面。IL-36γ可直接对树突细胞,自然杀伤细胞及巨噬细胞产生趋化作用,并可间接通过调控趋化因子的表达水平来调控中性粒细胞。IL-36受体敲除小鼠角膜感染后炎症反应加重,角膜溃疡恶化,而重组IL-36γ可极大减轻角膜感染引起的炎症,角膜水肿溃疡程度明显缓解,角膜透明度高,促进树突细胞及自然杀伤细胞趋化至感染部位,快速清除真菌,减缓炎症,IL-1β表达受到抑制。同时IL-36γ促进抗菌肽S1008/9,Reg3g和多种保护性因子如PTX3,TNF1IP3发挥的减轻炎症作用,减少中性粒细胞浸润,使真菌性角膜炎临床症状极大的改善。IL-36γ/IL-36R可促进由DC和巨噬细胞介导的天然免疫,在角膜抗白色念珠菌感染免疫应答中发挥积极的保护作用。