多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)属于血液系统恶性肿瘤的一种,以淋巴B细胞恶性增殖为主,约占血液肿瘤的10%。血管生成不仅在实体肿瘤中起重要作用,在血液系统恶性肿瘤尤其骨髓瘤中也起到重要作用。血管生成过程十分复杂,包括血管内皮细胞的增殖、迁移、管腔的形成等过程。近年来研究发现,Rho(Ras homologous)家族中的成员之一RhoC,除了参与调节肿瘤细胞的骨架形成、细胞运动、细胞增殖、细胞凋亡、细胞转录、细胞转化及肿瘤细胞的浸润和转移外,还参与肿瘤血管的形成。肿瘤血管的生成受到肿瘤微环境、肿瘤细胞和各种生长因子等多种物质共同介导,过程十分复杂。单纯以骨髓瘤细胞为靶点进行抗肿瘤血管生成并不能取得令人满意的效果。研究发现,RhoC在多发性骨髓瘤细胞和血管内皮细胞中均有表达,而RhoC在肿瘤组织中的高表达往往与血管的形成有密切的关系,因而推测RhoC在血管内皮细胞中的表达参与了血管内皮细胞形态和功能的调节,进而起到了促进骨髓瘤组织中的血管生成的作用。通过构建RhoC shRNA质粒和慢病毒载体,在体外转染骨髓瘤血管内皮细胞(myeloma vascular endothelial cells MVECs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs);采用Western blot和qRT-PCR进行检测细胞中RhoC表达情况;采用罗丹明标记的鬼笔环肽进行细胞骨架染色,并运用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架;扫描电子显微镜观察内皮细胞伪足形态和数量;采用划痕实验检测RhoC对血管内皮细胞迁移能力的影响;在Matrigel基质胶上观察RhoC对血管内皮细胞成环能力的影响;采用Cytodex 3微载体培养内皮细胞,将细胞微载体球接种在Matrigel基质胶上观察内皮细胞出芽数目;采用Western blot技术检测ROCK和MAPK蛋白表达情况。探讨RhoC与血管内皮细胞功能关系的研究,将为进一步阐明骨髓瘤血管生成机制和临床肿瘤血管生成的靶向治疗提供理论依据。材料和方法1骨髓瘤血管内皮细胞的分离和鉴定收集骨髓瘤患者组织标本,无菌条件下于冰上取病灶无坏死组织,使用抗CD14、抗CD45、抗CD64磁珠进行阴性筛选,去除样品中混杂的单核细胞、淋巴细胞和粒细胞,然后进行细胞培养。采用免疫细胞化学方法检测CD31、CD34、vWF、CD105等血管内皮标志物鉴定该细胞。2培养骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞并检测Rho C表达使用Gibco胎牛血清和DMEM培养基培养血管内皮细胞,免疫细胞化学、Western blot和qRT-PCR技术检测血管内皮细胞中RhoC蛋白和RhoC mRNA表达情况。3转染骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞3.1 RhoC shRNA质粒构建及分组构建RhoC shRNA质粒,针对人源RhoC设计4条干扰序列S1:RhoC shRNA-1;S2:RhoC shRNA-2;S3:RhoC shRNA-3;S4:RhoC shRNA-4;以及1条无关序列NC:RhoC shRNA-NC;将5条RhoC shRNA质粒分别转染骨髓瘤血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞中,通过荧光显微镜和Western blot技术筛选出最佳干扰序列。并使用最佳干扰序列(S组)和阴性对照组(NC)进行后续实验。3.2采用脂质体转染方法将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染待细胞生长至60%时,将上述各组质粒分别与脂质体进行充分混合,然后加入各组细胞中,12h后换成完全培养基。分别观察转染后24h、48h、72h细胞转染效率,并检测各组干扰效果。转染效率评定按照每200×视野下荧光细胞数目所占百分比计算,每组细胞随机选5个视野。3.3采用电穿孔转染方法将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染将培养的各组细胞消化混悬并转移至96孔板中,将电转液和上述质粒混合加入各孔中,调节电转仪参数并对培养的各组细胞进行电穿孔转染。具体观察时间和转染效率评定方法同上。3.4采用慢病毒载体将构建的质粒对血管内皮细胞进行分组转染使用上述构建的有效质粒进行慢病毒载体包装,将包装好的慢病毒载体工作液稀释成1:5,1:10,1:50三个不同的浓度梯度进行转染各组细胞,具体观察时间和转染效率评定方法同上。3.5观察各组MVECs和HUVECs的细胞骨架、伪足形成将各组细胞进行细胞爬片,使用罗丹明标记的鬼笔环肽染液和DAPI染色,然后防淬灭液封片,使用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架;将各组细胞爬片使用锇酸固定,乙醇梯度脱水,干燥后使用扫描电子显微镜观察各组细胞伪足形态和数目。3.6观察各组MVECs和HUVECs迁移、二维成管和三维出芽能力分别将各组细胞在24孔板中培养待细胞铺满后,采用细胞划痕实验24h后检测各组细胞迁移能力;将各组细胞接种到Matrigel基质胶上,待细胞完全贴壁之后,加入500μl完全培养液,在24 h内观察各组基质胶上二维成管情况;首先将各组细胞接种到微载体球Cytodex 3上进行培养,待微载体球上细胞长满后移入铺有基质胶的各孔中,然后加入基质胶覆盖并添加完全培养液,每天均进行观察各组微载体上内皮细胞出芽情况,观察时间持续一周。3.7检测各组MVECs和HUVECs中ROCK、MAPK蛋白质和mRNA表达情况将各组细胞分别进行转染,转染并培养24 h后在冰上裂解各组细胞,采用Western blot技术检测各组细胞中ROCK、MAPK蛋白的表达;采用qRT-PCR技术检测各组细胞中ROCK、MAPK mRNA的表达。4统计学处理使用SPSS 17.0软件进行数据分析,所有计量资料均采用x±S表示,两组之间可以采用独立样本t检验,两组以上的均数之间进行比较,符合条件的数据可以采用单因素方差分析(ANOVA),检验水准均为а=0.05。结果1骨髓瘤血管内皮细胞体外分离以及鉴定经免疫磁珠分选并采用免疫细胞化学方法分别检测细胞中CD31、CD34、vWF、CD105的表达,免疫细胞化学实验结果均显示阳性,故可认为该细胞为血管内皮细胞。2鉴定MVECs和HUVECs中RhoC表达经免疫细胞化学实验、Western blot和qRT-PCR技术检测所分离并培养的血管内皮细胞及HUVECs中RhoC表达情况,结果显示,RhoC在两种细胞中均阳性表达。3 RhoC shRNA质粒和慢病毒载体在MVECs和HUVECs中转染效率及干扰效果3.1转染效率评价在荧光倒置显微镜下观察各组细胞质粒转染72 h后,脂质体转染、电穿孔转染、慢病毒载体转染,三种转染方法对血管内皮细胞转染效率分别为:(10.3±3.5)%,(5.3±1.5)%,(90.3±3.5)%,其中慢病毒载体转染效率最高(P<0.05)。3.2各组细胞中RhoC干扰效果评价采用Western blot检测两组细胞中RhoC蛋白干扰前后表达情况,结果发现,两组细胞培养48 h之后,干扰组(S组)较阴性对照组(NC组)RhoC蛋白表达含量明显降低(P<0.05)。其中最佳干扰序列为S3组。4 RhoC shRNA在MVECs和HUVECs中表达对细胞骨架、伪足形成的影响经激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察转染后的各组细胞发现,两组细胞中RhoC S组较NC组细胞轮廓更加规则、丝状伪足数目明显减少(P<0.05)。5 RhoC shRNA对各组MVECs和HUVECs迁移、二维成管和三维出芽能力的影响转染MVECs和HUVECs 48 h后,检测RhoC对两种细胞相关功能的影响,结果发现RhoC S组较NC组细胞细胞迁移能力明显降低(P<0.05);二维成管数目以及出芽数目和能力均降低(P<0.05)。6各组MVECs和HUVECs中ROCK、MAPK蛋白质和mRNA表达情况Western blot检测ROCK、MAPK蛋白表达,经Image J软件灰度分析,S组ROCK、MAPK蛋白质表达量明显低于NC组,经统计学分析两组之间有差异(P<0.05)。qRT-PCR进行检测ROCK、MAPK mRNA表达,结果显示ROCK、MAPK mRNA在实验组中含量明显低于对照组中含量,经统计学分析可以认为实验组和对照组之间不同(P<0.05)。结论1下调MVECs中RhoC表达,可影响MVECs的骨架结构和伪足形成,并且抑制血管内皮细胞二维血管网格管状结构形成和三维出芽能力。2通过下调MVECs中RhoC表达影响MVECs细胞骨架结构、伪足形成、二维血管网格管状结构形成、三维出芽能力,可能与RhoC/ROCK、RhoC/MAPK信号通路有关。3脂质体转染、电穿孔转染、慢病毒载体转染三种转染技术,转染效率最高的是慢病毒载体,而且对细胞损伤最小。