多花水仙(Narcissus tazetta Linn.)是石蒜科大家族中的重要一员,属于单子叶球茎类花卉,是我国传统十大名花之一,具有很高的观赏价值和一定的药用价值,主要产自福建、上海、浙江和江苏沿海一带。我国的多花水仙主栽品种比较单一,主要以‘金盏银台’和‘玉玲珑’为主,种质资源十分匮乏,由于多花水仙是同源三倍体,难以通过传统杂交育种的方式来进行品种改良,在很大程度上限制了水仙育种工作的顺利进行。又由于多花水仙长期的无性繁殖和病毒积累,导致其抗性减弱,品种退化,花亭、花数减少,香味变淡,严重制约了我国水仙产业的发展。因此,利用分子生物学以及基因工程的手段来改良水仙品种已成为一种新的有效的育种途径,其中对于花香以及抗性进行改良的研究具有很好的应用前景。主要研究内容及结果如下:1.分别提取‘黄花水仙2号’、‘金盏银台’和’白花水仙2号’花蕾期、盛花期的花瓣和副冠的RNA,并逆转录成cDNA。根据之前何炎森多花水仙差减文库中HDS基因的保守区片段,采用常规PCR和RACE技术分别克隆出三个不同水仙品种中HDS基因全长:NtHDSY、NtHDSJ和NtHDSW并作序列分析,实时荧光定量的结果表明:盛花期NtHDS基因的表达量明显比花蕾期高,说明盛花期合成大量的萜类物质诱导昆虫前来授粉,从而保证了植物群体遗传多样性和稳定性。2.从‘云香水仙’转录组数据库中初步筛选出NAC基因大家族中的7个不同NAC基因,以这些基因的片段序列来设计荧光定量引物,用浓度为100 μmol/L 的植物生长调节剂ABA胁迫处理‘云香水仙’萌芽期的鳞茎,提取叶片RNA并逆转录作为模板,通过荧光定量结果分析表明,编号为CL3249.Contig3和CL4883.Contig3两个NAC基因的表达量显著升高,很可能参与胁迫应答,因此可将这两个筛选出的NtNAC基因作为目的基因来进一步研究。3.根据筛选出的2个NAC基因在转录组数据库中的片段序列来设计特异性引物,采用常规PCR技术分别克隆出‘云香水仙’中与抗逆性相关的基因NtNACa和NtNACb,利用NtNACa基因的引物,克隆出‘黄花水仙2号’NtNACah基因进行同源性比较,并对克隆出的三个NtNAC基因作了生物信息学分析。同源性比对发现,‘云香水仙’NAC基因大家族中两个不同的NAC基因和其他植物NAC基因的同源性较高,而不同类型多花水仙品种’云香水仙’和’黄花水仙2号’中相同NAC基因的同源性差异较小;亚细胞定位发现,三个NAC基因均定位在细胞核内,这与卢敏博士和朱自果博士的研究结果一致。4.通过荧光定量结果分析NtNACa和NtNACb 基因在’云香水仙’不同组织以及在植物生长调节剂ABA、高温、PEG400和不同浓度NaCl胁迫处理下的表达情况。组织特异性表达结果发现,两个基因的表达量均在叶片中最高,根中次之,而在鳞茎内最低;不同胁迫处理结果分析可知,两个基因均对ABA胁迫较为敏感,NaCl、PEG400和高温胁迫次之;在24h短期胁迫处理时间中,大多数处理条件下,NAC基因在叶片中的表达量在第3小时达到最高;相同处理条件下两个基因在根中的表达量相较于叶片中的表达量变化更为显著。5.利用NAC基因大家族中克隆出的NtNACa和NtNACb基因,分别构建了重组质粒pBII1301-NtNACa-GUS和pBI1301-NtNACb-GUS,为后期转基因研究奠定良好的基础。