论文部分内容阅读
第一部分内质网应激诱导的细胞凋亡在大鼠急性坏死性胰腺炎肠损伤中的作用目的:本研究通过建立大鼠急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肠损伤模型,探讨内质网应激诱导的细胞凋亡在ANP肠损伤中的作用。方法:SPF级雄性SD大鼠16只,采用随机数法随机分为2组,分别为假手术组(Sham operation group,SO组)、急性坏死性胰腺炎组(acute necrotizing pancreatitis,ANP组)。采用逆行胆胰管注射牛磺胆酸钠法(0.06ml/100g)制备ANP大鼠模型,造模完成后过皮下注射的方式给与生理盐水进行补液(2ml/100g)。于ANP造模后12h剖杀大鼠,下腔静脉采血,离心分离血清,采用全自动生化仪测定大鼠血清AMY、LIPA水平,使用大鼠DAO ELISA试剂盒检测血清二胺氧化酶(DAO)水平。通过EKT-5Mset动态革兰氏阴性菌检测试剂盒测定血清内毒素的浓度。将来自胰腺和回肠的石蜡包埋的样品切片(5μm)分别进行苏木精-伊红(HE)染色。光镜下观察胰腺组织和肠道组织病理改变并进行病理评分。使用TUNEL染色测定法检测肠道上皮细胞凋亡过程中的DNA片段化。同时采用免疫组化法检测肠道组织GRP78、Caspase-12表达,提取肠道织蛋白后通过Western Blot法检测肠道Caspase-12、CHOP、Caspase-3表达水平。结果:与SO组相应时间点相比,ANP组各时间点大鼠血清AMY、LIPA、DAO、内毒素水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);胰腺组织、肠道组织损伤明显加重,病理评分显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05);肠道上皮细胞凋亡指数明显增大,差异具有统计学意义(P<0.05);肠道GPR78、Caspase-12的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Western Blot法检测肠道Caspase-12、CHOP、Caspase-3水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.使用逆行性胰胆管注射STC后12h,大鼠出现一定程度的胰腺坏死,以及肠道组织的损伤。2.内质网应激诱导的细胞凋亡可能是大鼠ANP发生肠损伤的机制之一第二部分4-PBA在大鼠急性坏死性胰腺炎肠损伤中的保护作用研究目的:使用化学伴侣4-苯基丁酸(4-PBA)对大鼠ANP进行干预,探究4-PBA对大鼠ANP时肠损伤的保护作用及机制。方法:24只SPF级SD成年雄性(8周,200-250g)使用随机数字表法随机分为3组(n=8):假手术组(SO组)、急性坏死性胰腺炎组(ANP组)以及4-PBA干预组(4-PBA组)。SO组仅接受开腹并翻动胰十二指肠。在4-PBA组中,大鼠以每天50mg/kg的剂量通过腹腔内注射4-PBA溶液,持续3天,其制备如下:将等摩尔量的4-PBA和氢氧化钠滴定至PH 7.4溶于生理盐水。在最后一次注射后,诱导ANP模型。在SO和ANP组中,大鼠皮下注射等体积的生理盐水取代4-PBA溶液进行补液。造模完成后12h剖杀大鼠,通过下腔静脉穿刺收集血样,随后在4℃下以3000rpm离心15分钟,并将血清在-80℃下分装储存。采用全自动生化仪测定大鼠血清AMY、LIPA水平,特定试剂盒检测血清DAO、内毒素水平。ELISA法测定大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平,将来自胰腺和回肠的石蜡包埋的样品切片并用HE染色,光镜下观察胰腺组织和肠道组织病理改变并进行病理评分。同时采用免疫组化法及RT-PCR法检测肠道组织GRP78,PERK,IRE1α,ATF6的表达水平。提取肠道组织蛋白进行western-blot法检测肠道Caspase-12,CHOP,Caspase-3的表达水平。TUNEL法检测肠道细胞凋亡水平;透射电镜行肠道超微结构检测。结果:1.与SO在相比,ANP组血清AMY、LIPA、DAO、内毒素水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与SO组相比,大鼠血液中IL-1β、TNF-α、IL-6在ANP组中表达明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);ANP组胰腺以及肠道组织病理评分相比SO相比,明显升高损伤明显严重,差异具有统计学意义(P<0.05);与SO组相比,ANP组肠道GRP78,PERK,ATF6的表达水平升高,然而IRE1α表达水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05);ANP组肠道Caspase-12,CHOP,Caspase-3水平显著高于SO组,差异具有统计学意义(P<0.05);ANP组肠上皮细胞的凋亡指数显著高于SO组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.与ANP组相比,4-PBA组大鼠血清AMY、LIPA轻微降低,差异不具有统计学意义(P>0.05),4-PBA组血清DAO、内毒素水平跟ANP组比较显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);4-PBA组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平与ANP组相比明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与ANP组相比,4-PBA组大鼠胰腺与肠道组织损伤明显降低,病理评分显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与ANP组相比,4-PBA组肠道组织GRP78,PERK,ATF6的表达水平下降,然而IRE1α的表达水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);4-PBA组肠道Caspase-12,CHOP,Caspase-3水平显著低于ANP组,差异具有统计学意义(P<0.05);与ANP组相比,4-PBA组肠道细胞凋亡指数明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.透射电镜下观察肠上皮细胞超微结构的变化。SO组中大肠的绒毛和肠上皮细胞保持了完整性。ANP组大鼠的肠上皮细胞表现出内质网广泛不规则的扩张。此外,观察到中度线粒体肿胀,并且嵴部分崩解。ANP组中的微绒毛和肠上皮细胞也表现出完整性的缺失。相反,4-PBA组的大鼠的微绒毛和肠上皮细胞完整性显着改善;内质网、核糖体和其他细胞器的超微结构变化也减弱。结论:4-PBA能减轻大鼠ANP时肠损伤,其可能机制是通过调节了内质网应激,进而减轻了内质网应激导致的细胞凋亡,从而减轻ANP时肠损伤。