嗜酸乳杆菌表面疏水空间的修饰及其催化亚油酸为共轭亚油酸的特性研究

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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是亚油酸(linoleic acid LA)的同分异构体,具有重要的生理功能。利用酶法可以合成CLA,嗜酸乳杆菌含有亚油酸异构酶,具有转化LA生成CLA的催化能力,其催化效率与其表面疏水性、细胞膜通透性和反应介质的性质有关。本论文研究了嗜酸乳杆菌细胞表面疏水性的变化与其表观酶活的关系,研究了细胞表面疏水性的影响因素并进行了优化;探讨了透性化处理对全细胞表观酶活的影响并进行了优化;筛选出一种优良的反应体系,并对体系的反应条件进行了优化。在不同的疏水环境下研究嗜酸乳杆菌全细胞酶的酶活变化规律,结果显示酶活性随着菌体表面疏水性的增强而增强,菌体表面疏水性与其亚油酸异构酶酶活成正相关关系,回归方程为:y=1.5500x+78.163,R2=0.7507,相关系数达0.7507,模型具有较高的拟合精度。对嗜酸乳杆菌的培养基成分和培养条件进行优化,通过单因素实验确定了各因素的最佳水平,采用响应面法对影响疏水率条件进行了优化,最终得到的提高菌体表面疏水性的条件为:生长时间15.7h、生长温度为37℃、葡萄糖浓度4%、蛋白胨/酵母提取物2:1、碳氮比2:1、CH3COONa0.4%、柠檬酸氢二铵0.15%、吐温-80(v/v)0.181%、磷酸盐缓冲液pH4.0、菌悬液浓度为1.0×109cfu/mL。比优化前疏水率提高了13.6%。在最优疏水条件下培养嗜酸乳杆菌,通过不同透性化试剂处理嗜酸乳杆菌细胞,并分析了全细胞酶活力的变化,用正交设计优化了透性化条件,结果显示,当以25%丙酮为透性化剂,处理时间为40min,处理温度为40℃时,酶活高达398.65U/g,是酶粗液酶活的4.7倍,转化率为80.35%,比优化前提高了6.73%。以高疏水性和高通透性的嗜酸乳杆菌为研究对象,研究了不同反应介质对CLA产量的影响,筛选出最佳反应介质为丙三醇。通过单因素实验,确定了在丙三醇反应体系中最适反应条件,并采用响应面法对生物转化条件进行了优化,最终得到提高CLA得率的最佳反应条件:反应时间为23.7h、反应温度为36.5℃、底物浓度为1.1mg/mL、细胞浓度为4.0×109cfu/mL。在此条件下CLA的浓度为8.422mg/mL,纵观全文,比正常细胞提高了46.31%,比酶粗液提高了36.61%。
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