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背景与目的:甲基汞（MeHg）是一种普遍存在于环境中的污染物,虽然中枢神经系统是其主要的靶器官,但是对肝脏等非神经器官同样产生毒性损伤。HIF-1α作为低氧调节因子在机体缺血缺氧及化学性损伤应答中发挥着重要的细胞保护或细胞损伤作用。我们以PC12细胞作为神经元样细胞模型,以BRL细胞作为非神经细胞模型,探究神经元及非神经元细胞对MeHg毒性敏感性的差异,并进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在MeHg毒性中的作用,分析MeHg调控HIF-1α的可能机制。利用不同的方式分别从基因、蛋白方面调控HIF-1α,观察MeHg神经及肝损害效应的变化。一方面探究MeHg毒性机制与HIF-1α的关系,为MeHg中毒后所致的不同器官的损害提供诊断指标,同时评估上调HIF-1α对拮抗MeHg毒性效应的影响,研发针对不同MeHg毒性损害系统的有效拮抗剂。方法:1.根据前期的预实验,选择不同浓度的MeHg（0、1、2.5、5、10μM）分别处理PC12和BRL细胞不同时间（0、0.5、1、3、6 h）后,利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测PC12及BRL细胞活力,评估其剂量-时间效应关系;利用乳酸脱氢酶漏出率（LDH）检测不同浓度（0、1、2.5、5、10μM）MeHg作用0.5 h后的细胞毒性作用;利用光学显微镜观察不同浓度MeHg作用后细胞形态学的变化;采用DCFH-DA荧光探针检测两株细胞中活性氧（ROS）随MeHg浓度改变后的改变情况,综合评价MeHg对PC12及BRL细胞的毒性作用及其差异。2.蛋白免疫印迹法（WB）用于检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,荧光定量PCR（RT-PCR）用于检测MeHg作用后HIF-1αmRNA水平的变化。探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用。利用药理学（2-MeOE2,10μM,0.5 h）抑制HIF-1α蛋白的表达,WB法检测蛋白变化,MTT法检测细胞活力进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在甲基汞致PC12及BRL细胞毒性中的作用。3.腺病毒过表达调控HIF-1α,WB法检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,MTT法检测细胞活力,以探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用,基因水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响。4.利用脯氨酸羟化酶抑制剂（DHB,1 mM,6 h）、（CoCl2,200μM,0.5 h）及蛋白酶体抑制剂（MG132,1μM,24 h）抑制HIF-1α的降解后,利用WB检测蛋白的变化,MTT检测细胞活力,一方面探讨从蛋白水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响,另一方面探讨MeHg调控HIF-1α的可能机制。结果:1.MTT结果表明,MeHg以剂量-时间依赖性的方式降低PC12及BRL细胞活力,PC12细胞中,MeHg浓度为5μM作用0.5 h后细胞活力下降具有统计学意义;在BRL细胞中,MeHg浓度为为10μM作用0.5 h后细胞活力显著下降;MeHg浓度为10μM作用0.5 h后,PC12和BRL细胞活力分别下降至68%和76%。LDH结果表明,在PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM时,LDH漏出率显著增高;而在BRL细胞中,MeHg浓度为10μM时,LDH漏出率明显升高。不同浓度MeHg作用0.5 h后两株细胞内的ROS的水平亦明显增高,同样浓度的MeHg处理后,在PC12细胞中,荧光强度强于BRL细胞中的荧光强度。2.WB结果表明不同浓度MeHg作用0.5 h后,在PC12和PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM和5μM时HIF-1α下降具有统计学意义。MeHg浓度为10μM作用0.5 h,HIF-1α蛋白表达下调至对照组的12%及54%。MeHg作用后对两株细胞的HIF-1β的水平无明显影响。MeHg亦以剂量依赖性方式下调两株细胞中HIF-1α的下游靶蛋白如GLUT-1、VEGF-A、EPO等。qRT-PCR结果表明,MeHg作用后对两株细胞的HIF-1αmRNA的水平亦无明显影响。利用2-MeOE2下调HIF-1α后能够进一步诱导MeHg所致的HIF-1α及其下游蛋白的表达下调并能加重因MeHg所致的细胞活力的下降,进一步论证HIF-1α参与甲基汞诱导的神经毒性和肝脏毒性损害。3.在基因水平上,利用腺病毒上调HIF-1α后,能够显著逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,拮抗MeHg所致的两株细胞毒性。4.在蛋白水平上,采用PHD抑制剂DHB、CoCl2预处理,可显著逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,CoCl2预处理可以明显拮抗MeHg所致的BRL细胞毒性损害,DHB预处理能够明显拮抗MeHg所致的两株细胞毒性损害,且拮抗MeHg所致的BRL细胞毒性更加明显。利用蛋白酶体抑制剂MG132预处理后亦能明显拮抗因MeHg所致HIF-1α及其下游蛋白的下调并明显拮抗MeHg的毒性,其中对MeHg所致的PC12细胞的毒性的拮抗作用更加明显。结论:神经元样细胞PC12细胞相对于大鼠肝BRL细胞对MeHg的毒性更加敏感。其机制可能与MeHg对HIF-1α及其下游靶蛋白（GLUT1、VEGF-A、EPO）的下调幅度不同有关。MeHg作用后不影响HIF-1α的转录水平而有可能是通过促进PHD依赖的蛋白酶体途径的降解。从基因水平和蛋白水平分别上调HIF-1α后可以拮抗MeHg所致的两株细胞的毒性,但拮抗效率不同,PHD抑制剂对拮抗MeHg致BRL的毒性效率要强于PC12细胞,蛋白酶体抑制剂对MeHg所致的PC12细胞的毒性的拮抗效率要强于BRL细胞。一方面提示HIF-1α可作为拮抗MeHg毒性的通用靶点,为HIF-1α作为血清学指标用于MeHg中毒的诊断提供新的方向,另一方面为选择针对不同系统的MeHg毒性的有效拮抗剂提供理论依据。