基于多组学分析的日本囊对虾生长调控机制初步研究

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甲壳动物作为无脊椎动物中最大的类群之一,具有潜在的巨大经济价值。生长性状是经济类甲壳动物最重要的性状之一,直接影响养殖品种的产量与经济效益。然而,迄今为止甲壳动物生长性状的生物学机理研究并不充分,尤其是在日本囊对虾等十足目动物中。本文以日本囊对虾为研究对象,构建日本囊对虾零换水养殖模式,基于形态学分析研究该模式下日本囊对虾生长规律。在此基础上,进一步借助多种技术手段对同一家系不同生长阶段体质量显著差异的日本囊对虾从生理生化、肠道菌群、基因层面、蛋白层面和代谢物层面进行研究,旨在解析日本囊对虾生长调控机制。以期为完善甲壳动物生长性状基础理论提供参考资料,为对虾乃至其它经济类甲壳动物育种和养殖提供理论支撑。主要结果如下:本研究以构建的日本囊对虾全同胞家系为实验材料,采用零换水养殖模式养殖日本囊对虾,日本囊对虾在无底质、不换水的情况下,存活90 d以上并且活力良好。试验期间水体理化因子稳定,pH 为(8.13±0.07)~(8.61±0.01),NH4+-N 为 0~(0.769±0.124)mg/L,NO2--N为0~(0.167±0.034) mg/L,NO3--N为0~(1.267±0.120) mg/L。该模式下日本囊对虾的生长大致分为两个生长阶段:30~50日龄为快速生长期,特定生长率和相对增长率最大,分别为4.28~9.51 %/day和53.46%~158.83%;50~100日龄为稳定生长期,特定生长率为2.15~2.37 %/day,相对增长率为24.00%~26.7 1%。本研究构建日本囊对虾零换水养殖模式并证实其具有可行性,得到该养殖模式下日本囊对虾生长规律,为后续研究取样时间的选择提供了依据,为日本囊对虾生产实践提供了理论参考。通过对不同生长阶段体质量显著差异的日本囊对虾生理生化指标和肠道菌群进行分析,来研究动态变化的生理指标与日本囊对虾生长之间的关系。快速生长组(FG)α-淀粉酶(α-Amylase,AMS)活性在40和100日龄高于缓慢生长组(SG),FG组脂肪酶(Lipase,LPS)活性在每个生长阶段均高于SG组,胰蛋白酶(Trypsin,TRS)活性刚好与LPS相反。FG组溶菌酶(Lysozyme,LZM)活性在每个生长阶段均高于SG组。FG组过氧化氢酶(Catalase,CAT)和总超氧化物歧化酶(Total Superoxide Dismutase,T-SOD)活性在40日龄高于SG组,在100日龄时刚好相反。12个肠道菌群样品的Q20均在73.63%以上,Clean Reads均在90.29%以上。注释到2,771个OTUs,FG组OTUs数量高于SG组,1,484个OTUs为两组共有。FG和SG组Alpha Diversity指数无统计学差异(p>0.05)。在门分类水平上,FG组厚壁菌门(Firmicutes)丰度高于SG组(p>0.05);在属分类水平上,FG组弧菌属(Vibrio)丰度低于SG组(p>0.05)。FG组碳水化合物代谢(Carbohydrate Metabolism)功能高于SG组(p<0.05)。对全虾体成分分析,FG组水分含量比SG组低(p<0.05),粗蛋白含量比SG组高(p>0.05)。上述结果表明,FG组日本囊对虾可能通过增强对碳水化合物和脂肪的吸收、利用能力,以及减少一些不必要能量的消耗,来合成更多蛋白质,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显著差异的日本囊对虾进行转录组学分析,获得111.64 Gb Clean Data,鉴定到10,194个基因。日本囊对虾全长转录组相比二代组装转录组,得到的基因平均长度更长,基因注释率更高。在特定生长率大的快速生长期(40日龄)相比特定生长率小的稳定生长期(70日龄),鉴定到更多差异表达基因(DEGs)。215个DEGs为快速生长期和稳定生长期共有,其中106个DEGs在两个生长阶段表达趋势一致,其余109个趋势相反。通过qPCR对在两个生长阶段表达趋势一致的DEGs进行验证,实验结果与转录组一致,证实转录组数据可靠。快速生长期和稳定生长期得到的DEGs功能相对保守,包括糖酵解(Glycolysis)通路在内的12条显著富集通路为两个生长阶段共有。首次报道Hippo信号通路(Hippo signaling pathway-fly)直接参与甲壳动物生长,克隆得到该通路中的关键基因Mj14-3-3-like。其ORF为741 bp,编码246 个 AA。 Mj14-3-3-like在快速生长组对虾高表达,在蜕皮间期表达量最低,这些结果表明Mj14-3-3-like可能负调控日本囊对虾生长。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显著差异的日本囊对虾进行蛋白质组学分析,鉴定得到1,720个蛋白质。在日本囊对虾快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到52和70个差异表达蛋白(DEPs)。10个DEPs为快速生长期和稳定生长期共有,并且每个DEP在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能是日本囊对虾潜在的生长标志物。对蛋白质组和转录组做联合分析,在快速生长期和稳定生长期分别筛选到10和7个DEPs/DEGs,大多数基因表达趋势一致。蛋白质组、转录组和qPCR均证实MHC-1a和MHC-1b在快速生长组对虾中低表达,提示它们可能负调控日本囊对虾生长。克隆得到Mj14-3-3-epsilon-like、MjGPI和MjGPD1,它们的ORF分别为822、1,671 和 1,098 bp,编码 273、556 和 365 个 AA。Mj14-3-3-epsilon-like 在快速生长组中低表达,在蜕皮间期表达量较低;MjGPI和MjGPD1在快速生长组中高表达,在蜕皮间期表达量较高;这些结果表明它们可能调节日本囊对虾生长。快速生长组对虾可能通过Hippo信号通路促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,实现生长优势;快速生长组对虾还可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。通过对来自同一家系不同生长阶段体质量显著差异的日本囊对虾进行代谢组学分析,在正、负离子模式下分别鉴定到2,342和1,811种代谢物。在正离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到229和275种差异代谢物;在负离子模式下的快速生长期和稳定生长期,分别鉴定到149和85种差异代谢物。在正、负离子模式下,分别有75和30种差异代谢物为快速生长期和稳定生长期共有,并且每种差异代谢物在两个生长阶段表达趋势一致,提示它们可能在日本囊对虾生长中起重要作用。通过ELISA试剂盒,对鉴定到的共有差异代谢物丙酮酸等进行检测,实验结果与代谢组一致,证实代谢组数据可信。在100日龄的快速生长组对虾中,丙酮酸含量同样低于缓慢生长组。这些结果表明丙酮酸是日本囊对虾一种潜在的生长标志物。快速生长组对虾可能通过激活包括糖酵解途径在内的多种代谢途径,实现生长优势。此外,本团队前期构建了一种地膜池养殖日本囊对虾模式,这种养殖模式以塘底铺设“地膜”取代传统养殖模式塘底铺设的“沙子”。该养殖模式下日本囊对虾可以存活5个月以上,不过相比传统养殖模式养殖的日本囊对虾生长缓慢,体色由黄变蓝。本研究通过对传统养殖模式和地膜池养殖模式养殖日本囊对虾鳃和肝胰腺进行比较转录组学分析,得到60,780个基因。在鳃中鉴定到1,005个DEGs (427个上调,578个下调),在肝胰腺中鉴定到115个DEGs (41个上调,74个下调)。这些结果表明鳃相比肝胰腺对外部环境变化更敏感。包括肌动蛋白和淀粉酶在内的多个必需基因受到抑制,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢的原因。虾青蛋白(Crustacyanin subunit A和C)在地膜池养殖日本囊对虾中高表达,可能是导致地膜池养殖日本囊对虾体色变蓝的原因。本研究初步解析了地膜池养殖日本囊对虾生长缓慢和体色变蓝的分子机制,为完善地膜池养殖模式提供了理论依据。
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