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保幼激素（Juvenile hormone,JH）信号通路在节肢动物的发育和生殖调控中发挥重要作用。甲基法尼酯（Methyl farnesoate,MF）被认为是甲壳动物中的JH等效物,但与昆虫的JH通路相比,在甲壳动物中只有少数报道证实了MF对卵巢发育有促进作用,对于其调控机制尚不清楚。甲壳动物JH通路作用的分子机制亟待深入研究。本研究以凡纳滨对虾为研究对象,通过对卵巢发育中多组织多时期的转录组分析,解析卵巢发育调控机制,从中筛选保幼激素通路等与卵巢发育相关的重要调控通路;采用离体组织孵育、dsRNA体内注射、酵母双杂交等分子技术对保幼激素通路重要基因的功能及表达调控机制开展研究,旨在阐明保幼激素通路调控对虾卵巢发育的分子机制,为完善甲壳动物卵巢发育基础理论提供参考资料。本论文的主要研究结果如下:1.基于转录组解析凡纳滨对虾卵巢发育调控机制本研究对凡纳滨对虾卵巢发育不同阶段的眼柄、脑、胸神经节、肝胰腺和卵巢5个与卵巢发育有关的重要组织进行了转录组分析,共获得了48,722条unigenes,其中18,661条unigenes在公共数据库匹配到功能注释信息。两两比较结果显示,各个组织均获得了大量差异表达基因,一些特定的表达趋势在卵巢发育过程中得到显著富集。通过权重基因共表达网络分析,聚类出6个与组织或阶段特异性相关的共表达模块。GO和KEGG富集分析进一步揭示了包括CHH家族神经肽、蜕皮激素信号、保幼激素信号、胰岛素-PI3K-Akt信号、EGFR信号和TGFβ信号通路在内的多个基因表现出组织特异性表达谱,暗示了它们在卵巢发育过程中的重要作用。本研究报道了与对虾卵巢发育有关的主要神经内分泌器官转录调控的综合分析,所获得的数据为揭示神经系统与其靶器官（即卵巢和肝胰腺）之间的潜在协调作用和深入了解对虾卵巢发育过程的分子调控机制提供了重要资源。2.凡纳滨对虾保幼激素受体基因LvMet的克隆及功能分析通过转录组数据库的分析筛选获得了保幼激素受体LvMet基因序列,利用PCR扩增技术得到长度为3,340 bp的LvMet cDNA序列,预测的ORF长3,165bp,编码1,054个氨基酸。与其他已知的Met相似,LvMet推导的氨基酸序列也包含bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC四个典型的结构域。在LvMet的PAS-B结构域中发现了与JH或MF结合有关的保守氨基酸残基。LvMet基因在神经和非神经组织中广泛表达,但在未成熟卵巢和肝胰腺中表达水平较低。随着卵巢发育进行,LvMet在肝胰腺和卵巢中的表达水平出现显著变化,表明LvMet可能参与了凡纳滨对虾的卵巢发育。适当浓度的MF可显著诱导离体卵巢和肝胰脏LvMet表达,但只有离体肝胰腺LvVg1和LvVg2被诱导表达。在雌性凡纳滨对虾体内注射MF,只有卵巢LvMet转录本的表达水平显著提高。这些结果证明了LvMet对MF的响应,并且LvMet可能参与了凡纳滨对虾的内源性卵黄发生。当沉默LvMet时,LvVg1在肝胰腺和卵巢的表达量变化趋势与LvMet在卵巢的变化趋势相似,均表现为先显著上调后下调至正常水平（P<0.05）。而肝胰腺LvVg2在24h明显下调（P>0.05）,但在48 h显著上调（P<0.05）,与LvMet的变化趋势相似。这些结果表明LvMet可能通过不同的方式参与凡纳滨对虾肝胰脏和卵巢中Vg的表达调控,并可能存在负反馈调控机制。3.凡纳滨对虾保幼激素受体LvMet与维甲酸X受体LvRXR间的作用关系通过PCR扩增获得了凡纳滨对虾1,325 bp的LvRXR c DNA序列,LvRXR mRNA在各个组织广泛表达,但在未成熟卵巢、眼柄和肝胰腺中表达水平最低。LvRXR在肝胰腺和卵巢中的表达量随着卵巢发育逐渐上调,在成熟期时达到峰值。适宜浓度的MF可以有效诱导肝胰腺体内、体外以及卵巢体内LvRXR表达,但MF抑制卵巢LvRXR体外表达。干扰LvRXR基因,LvVg1和LvVg2在肝胰腺和卵巢中都表现为先上调后下调。这些结果表明凡纳滨对虾的LvRXR基因表达同样受MF调控,并在Vg表达调控中发挥重要功能。干扰LvRXR后,LvMet的表达量变化趋势与LvRXR的变化趋势相似。干扰LvMet后,肝胰腺LvRXR表达量先显著上调,后显著下调至表达水平低于对照组（P<0.05）;卵巢LvRXR的表达量变化趋势与LvMet相似。酵母双杂交结果表明LvRXR和LvMet存在弱的相互作用,进一步证明了MF诱导Met与RXR结合形成异二聚体,参与凡纳滨对虾Vg表达和卵巢发育调控。4.凡纳滨对虾保幼激素通路下游基因LvKr-h1的功能研究通过PCR扩增从凡纳滨对虾中得到了2,021 bp的LvKr-h1,其中ORF预测长度为1,833 bp,编码610个氨基酸。与其他甲壳类动物Kr-h1基因相似,LvKrh1含有7个锌指结构（Zn2-Zn8）且序列高度保守。LvKr-h1 mRNA广泛分布在各个组织,但在未成熟卵巢、胸神经节和肝胰腺中表达水平最低。在眼柄完整对虾中,肝胰腺和卵巢LvKr-h1基因的表达量随着卵巢发育显著波动。眼柄切除后,肝胰腺和卵巢LvKr-h1表达量总体呈上升趋势,在成熟期（UES Ⅳ）表达水平达到峰值且高于眼柄完整对虾（INT Ⅳ）。高浓度MF均可显著诱导肝胰腺和卵巢LvKr-h1 mRNA体外、体内表达（P<0.05）。干扰LvKr-h1后,肝胰腺LvKr-h1的表达量显著下调,而LvMet基因表达明显上调,LvRXR在48 h显著下调（P<0.05）;在卵巢中,LvKr-h1的表达量明显上调,LvMet和LvRXR均呈现先上调再下调的表达模式。LvVg1和LvVg2在干扰LvKr-h1后显著上调。LvKr-h1可能参与了凡纳滨对虾的JH通路和Vg表达调控。干扰LvMet或LvRXR后,LvKr-h1的表达量均显著下调（P<0.05）。这些结果表明LvKr-h1受LvMet和LvRXR转录调控,并且可能存在负反馈调控机制。这些研究结果有助于深入了解凡纳滨对虾MF信号通路在凡纳滨对虾卵巢发育调控中的作用,并为阐明对虾繁殖调控的基础理论提供了重要的参考资料。