论文部分内容阅读
病原体给人类的健康形成了巨大的威胁。迅速追溯病原体传播的源头并及时有效的防控措施,可有助于减少和防止病原体的传播。对慢性感染病原体在体内的适应性机制进行研究,可对病原体检测、药物开发以及疾病治疗提供帮助。测序技术的发展已经可以很低的成本和较快的速度对大批量微生物样本进行全基因组测序,促进了病原体的传播和微进化研究。本文首先针对病原体传播和微进化建立了完善的实验和分析方法,并对每个环节的技术要点进行了明确。随后分别针对SARS-CoV-2病毒(新型冠状病毒)、铜绿假单胞菌、幽门螺旋杆菌这三种重要病原体分别基于病原体的特点、各自待解决的科学问题和研究目标,分别进行了样本采集、基因组测序和数据分析,实现了各自的研究目标,并进行了一些方法学的创新。具体研究工作包括以下4个方面的内容:首先,建立了适用于大多数病原体传播及微进化分析的完整方法学。本部分首先阐述了选择三种病原体的原因以及其代表性,之后基于细菌或病毒病原体的特点,以研究病原体传播及微进化为目标,建立了包括样本的采集、处理、相关信息收集、测序实验、测序数据分析的完整方法学流程,从而帮助快速、准确地实现病原体的传播和微进化分析。其次,基于全基因组扩增子测序对广州市复发新冠疫情的病毒传播和微进化进行了研究。本研究针对常用短扩增子引物体系常有较大的扩增偏性,不利于获得完整的基因组序列的问题,设计并测试了一套扩增子长度约为1000bp的多重扩增引物体系,可在真实样本可获得更均匀的基因组覆盖。同时,该引物体系也可在纳米孔测序上有较好的表现,并证实即使在较低的测序通量下也可获得准确的病毒基因组一致性序列,但纳米孔测序对宿主内异质性突变位点检测的准确率较低。基于上述建立的多重扩增引物体系,本研究对2020年3月开始的广州市复发新冠疫情进行了近乎实时的感染病例SARS-CoV-2基因组监测。通过病毒谱系鉴定和病毒序列的系统进化分析,确证了此次疫情是由海外输入性病例造成。另外,在此次疫情早期,海外输入病例携带的病毒已具有很高的基因组多样性,这些数据也提供了一些病毒数据缺乏的国家和地区的毒株谱系数据。然而,在广州市本地传播的病毒株较为单一,主要与来自非洲地区的两个病毒变体有关。根据本土病例的流调信息及所感染病毒的基因组特征,进一步实现了此次疫情病毒传播链条的回溯。总的来说,本研究基于基因组数据重构了传播链,为对入境者实行严格防疫管控等公共卫生政策提供了科学依据和数据,体现了病毒全基因组测序在新冠疫情防控中的作用。接着,基于全基因组测序研究了铜绿假单胞菌在ICU住院病人体内的微进化。通过从7位长期(4-19个月)在重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)住院的高龄病人体内持续采集如痰液、创口分泌液等日常护理标本,并进行细菌培养和鉴定。铜绿假单胞菌为最为常见的分离细菌,故选择铜绿假单胞菌进行全基因组测序,并以此纵向采集的分离株样本来研究铜绿假单胞菌在住院病人体内的动态性和微进化过程。基于核心基因组的系统进化分析和多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST),发现了其中两个病例感染了相同的菌株,同时也发现在两个病人体内随时间发生了多次不同铜绿假单胞菌菌株转换,这是首次在住院病人体内发现铜绿假单胞菌菌株转换的情况。基于突变的宿主内多样性分析,在两位病人分离的两个MLST型菌株中发现了超突变表型(hypermutator phenotype),不仅基因组点突变数目明显多,并且富集于连续碱基区的插入缺失突变。该两个超突变菌株均分别在错配修复基因mutL中发现了同超突变关联的异义突变。另外,本研究也对不同MLST分型的铜绿假单胞菌菌株进行了横向比较,发现多个基因在独立微进化过程中均发生了突变,这些基因很多同铜绿假单胞菌从体外环境到体内环境的适应性过程相关,如fptA和pvdS,其他一些同耐药相关,如mexZ、lasR、fleQ等。最后,基于结构变异的分析发现了两个与耐药基因和鞭毛基因有关的长片段缺失突变事件。总之,本研究通过连续采样结果全基因组测序的方式,可对病人体内的铜绿假单胞菌超突变表型进行监测;而细菌宿主内的多样性及纵向和横向比较表明,ICU住院病人体内的铜绿假单胞菌具有趋同微进化模式,加深院内感染背景下铜绿假单胞菌在宿主内的微进化的认识。最后,开发建立幽门螺旋杆菌异质性亚克隆分型方法,对幽门螺旋杆菌在宿主内多样性和微进化进行了研究。本研究选择了具有胃部多个部位分离培养幽门螺旋杆菌样本的病例为研究对象,并分为了对左氧氟沙星和克拉霉素有耐药差异租(14人,41份样本)及无耐药差异组(11人,31份样本)。利用下一代测序(NGS)和单分子测序技术相结合的方案对幽门螺旋杆菌培养菌液(未经过连续传代)进行全基因组测序,获得了一致性(consensus)基因组,并构建了基于全基因组的系统发生树。在一致性基因组水平,发现存在一个多重感染的病例,即胃不同部位定植有不同的菌株,且分别属于东亚谱系(hspEAsia)与欧洲谱系(hpEurope)。在进行亚克隆水平的深入分析后,发现了另一个病例也存在副克隆级别的多重感染。其他病例的宿主内多样性相比较低,可认为多样性来自于宿主内微进化。通过比较分析发现,在一致性序列分析水平和亚克隆分析水平上,有耐药差异病例组的菌株宿主内多样性在统计上均显著高于无耐药差异病例组。为了进一步细致地分析幽门螺旋杆菌宿主内多样性,本研究将NGS和PacBio测序数据联用,实现了亚克隆级别的宿主内突变位点的定相(phasing),在亚克隆单倍型水平刻画了幽门螺旋杆菌宿主内基因组图谱。结果表明,排除多重感染样本后,重组导致的突变在幽门螺旋杆菌宿主多样性形成中占据绝对主导地位。在宿主内差异突变数超过400的16个样本中,重组贡献的突变占比保守估计为94.5%。通过对来自重组的突变进行供体追溯,并进行可视化,获得了重组区域块的长度分布,其中位长度为445bp。进一步,本研究重点研究了左氧氟沙星耐药相关gyrA基因和克拉霉素耐药相关23S rRNA基因。在两个病例中直接观测到了gyrA的耐药突变由于重组形成不同的亚克隆。另外,在病例P4中也发现了23S rRNA基因上耐药突变来自重组的迹象。总的来说,本研究基于NGS和长片段测序联用的手段,通过分析方法学的创新,首次实现了亚克隆单倍型水平的幽门螺旋杆菌微进化基因组分析,获得了高精度的宿主内基因组图谱。结果表明,重组是幽门螺旋杆菌宿主内多样性的主要产生机制,并可能导致同一宿主的不同克隆产生耐药性差异,这增加了对幽门螺旋杆菌微进化的认识。总的来说,本研究选择了三种不同病原体,都基于全基因组测序进行了相应的传播和微进化研究,不仅实现了各自对于病原体传播分析,也基于纵向样本或者在更亚克隆级别对病原体在宿主内的适应性和微进化进行了深入的研究,充分体现了全基因组测序在病原体传播和微进化方面的作用。